ASH 2014：游离循环DNA测序可检测HL患者的基因失衡

背景：霍奇金淋巴瘤(HL)在所有淋巴瘤中占11-30 %，是青少年和年轻的成年人最常见的一种淋巴瘤。现在，HL大部分是可治愈的，但10 - 15 %的患者会出现化疗不敏感或一线治疗后复发。霍奇金/ Reed-Sternberg (HRS)细胞是经典型霍奇金淋巴瘤(cHL)中的恶性细胞，仅占在cHL活检组织所有细胞的0.1 - 2 %，而其它部分则是由非恶性的免疫细胞混合组成。HRS的稀少严重妨碍了对cHL遗传性病变复发的确定以及对其发病机制、生物学行为和疾病多样性的阐明。

方法：这是一个前瞻性研究，我们采用大量同步定序法来检测的患者的游离循环DNA(ccfDNA)，这些患者都经活检证实患有结节性硬化型cHL(NSHL)，临床分期IIA-IVB期。荧光原位杂交(FISH)法检测肿瘤标本中HRS细胞的基因失衡以结果：最近，我们完成了一项非侵入性的产前测试怀孕的新方法。基于ccfDNA的大量同步定序法，可对胎儿非整倍体和节段性失衡进行全基因组检测。其中一例孕妇，检测到多个基因失衡复杂的表达谱。在排除胎儿和产妇机体本身的异常后，我们考虑产妇或胎儿具有患肿瘤的可能性，最终经活检证实孕妇患有II期(早期)结节硬化性霍奇金淋巴瘤(NSHL)。

为了验证ccfDNA中基因失衡的起源，我们采用FISH法分析福尔马林固定石蜡包埋病理切片中少见的HPS细胞。在HRS细胞中可发现相应的8号染色体长臂末端扩增， 9号染色体短臂末端扩增和14号染色体长臂末端扩增，足以证明此患者ccfDNA表达谱的异常是来自HRS细胞的DNA。

为了进一步证实这一现象，我们前瞻性收集了9例NSHL患者(年龄12~65岁)初治(8例)或复发(1例)的ccfDNA。7例患者为IIa期，2例IVb期。通过大量同步定序法在8例患者中测得ccfDNA基因失衡。

让我们感到更有把握的是，基因失衡好发部位已在之前的文献中报道，这些研究利用阵列比较基因组杂交(Array Comparative Genome Hybridization，aCGH)法显微切割HRS细胞来检测cHL患者的基因失衡。

此外，我们利用FISH法广泛验证了所有患者肿瘤标本中HRS细胞的ccfDNA表达谱可能出现的失衡。这与24个实验检测取得了一致的结果， 与两个实验结果部分一致，仅与三个实验结果不一致。结合FISH与CD30免疫染色结果显示，异常杂交模式的巨细胞多为CD30阳性，可明确这类细胞为HRS细胞。正常杂交模式的细胞多为CD30阴性。ccfDNA的基因失衡和FISH测得的HRS细胞显著的一致性，有力的证明了ccfDNA包含的DNA来自HRS细胞的DNA。

尽管表达谱的异常在IVb期患者中更为显著，但在本实验8例患者中有7例为IIa期患者，这些患者同样也可检测到异常。所有的患者，包括妊娠期患者，都接受以ABVD为基础的方案化疗，并且客观疗效经早期临床体检和影像学评估确定。所有患者ccfDNA表达谱的快速正常化和治疗开始具有平行关系，特别要强调是我们证实了异常ccfDNA表达谱和HRS细胞负荷之间的关系。此外，在cHL中，ccfDNA表达谱可作为一个潜在的分期和早期疗效检测的工具。

通过免疫组织化学手段可在肿瘤活检切片中检测到细胞周期的指标Ki67及激活的caspase-3的表达， 分别在10例患者HRS细胞检测到Ki67，6例患者可检测到激活的caspase-3，并且意外发现与高HRS细胞负荷相一致。

结论：采用非侵入性的游离循环DNA(ccfDNA)大量同步定序法，可检测到临床早期及晚期结节硬化性霍奇金淋巴瘤L患者HRS细胞中基因组失衡现象。

确定HRS细胞ccfDNA的基因组状态的方法，为我们展开了一个未来探索cHL的生物学行为和评估早期及晚期cHL的诊断和治疗结果的崭新的的视角。这一新发现将有力促进生物标记物的发展和新生物制剂临床试验设计的改进，并可能促进cHL治疗的针对性和精确性。

黄慧强教授在ASH 2014会议现场

        专家点评

中山大学肿瘤医院内科黄慧强教授：目前恶性肿瘤的早期诊断、早期疗效确定和治疗后微小病灶的监测，都是现阶段肿瘤血液学领域的热点研究内容;霍奇金淋巴瘤(HL)作为特殊类型的淋巴瘤其临床诊断和治疗要求均很高，不但要治愈HL患者，而且需最大限度降低治疗的远期不良反应，并且不良反应发生率和严重程度与HL的诊断时机有关，然而，HL病理学的最大特点是肿瘤组织中大部分是非恶性的免疫细胞成分，而肿瘤细胞(RS细胞)的比例极低，因此，除了有足够肿瘤组织的病理诊断比较容易外，其他如细针穿刺细胞学或脱落细胞学等，均难以确诊HL，从而造成殊病人的难以早期准确诊断，从而延误最佳的有效治疗。

2014年美国血液年会上，来自欧洲比利时 Leuven大学Peter Vandenberghe等采用大量同步定序法通过检测游离循环DNA(ccfDNA)进而检测霍奇金/ Reed-Sternberg细胞的基因失衡情况，在HL该研究的设计思路首先受到采用同法作孕妇产前检测。意外确诊了孕妇患有HL的启发，然后在HL石蜡包埋组织中进一步确立基因失衡来源于HL的RS细胞DNA，最后，该研究在新诊断的HL患者外周血中进行监测验证，最后首次证明ccfDNA表达谱与RS细胞负荷相关，与化疗效果相关，因此，在cHL中，ccfDNA表达谱可作为一个HL早期诊断和早期疗效检测的全新工具。这一研究观察结果将有力促进生物标记物的发展和新生物制剂临床试验设计的改进，对提高cHL整体治疗水平大有裨益是今年ASH会议淋巴瘤领域值得关注的进展。

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