Gut：PRMT5作为胆管癌的潜在治疗靶点！

胆管癌（CCA）是一种极具侵袭性的恶性肿瘤，根据其在胆道系统中的位置，可分为肝内（iCCA）、肝门周围和远端CCA，其中后两者统称为肝外CCA（eCCA）。全球CCA的发病率呈现上升趋势，主要是由于肝内CCA病例的增加。患者通常在疾病晚期被诊断出来，此时手术治疗已不再可能，而化疗往往只能起到缓解症状的作用，导致患者五年生存率极低，仅在7%到20%之间。

通过高通量测序分析，科学家们已经揭示了CCA的分子特征，并发现了一些可操作的基因变异，例如在肝内CCA中发现的FGFR2融合和IDH1突变，以及在肝外CCA中更常见的HER2扩增和KRAS突变。这些发现促进了靶向治疗的发展。针对这些特定基因变异的药物在某些患者中显示出了积极的临床活性。然而，这些变异的发生率较低，而且随着时间的推移，患者可能会产生耐药性，这限制了这些药物的疗效。

此外，作为单一疗法的免疫检查点抑制剂（ICI）在临床研究中的效果并不理想，这与胆道癌中错配修复缺陷、微卫星不稳定性或肿瘤突变负担的低发生率相一致。这些发现推动了将细胞毒性药物、靶向治疗和免疫疗法结合起来的联合疗法的发展，这些联合疗法已经展现出了有希望的初步结果。

尽管如此，CCA仍然是一种难以治疗的癌症。因此，研究人员正在积极探索新的治疗方法。这些新方法可能基于对CCA生物学特征的新发现。越来越多的证据表明，表观遗传变化在CCA的发生和发展中起着重要作用。这些变化不仅限于参与染色质重塑的基因突变，还包括DNA甲基化和组蛋白翻译后修饰（PTMs）的变化。表观遗传修饰的可逆性使它们成为药物干预的理想靶点。

在这些修饰中，精氨酸甲基化尤其值得关注，它是由一组蛋白精氨酸甲基转移酶（PRMTs）催化的。PRMT5是其中之一，它在癌细胞和组织中高度表达，并且其过表达与多种实体瘤的肿瘤进展直接相关。PRMT5与甲基体蛋白50（MEP50）结合，形成复合物，催化组蛋白尾部精氨酸残基的甲基化，这导致肿瘤抑制基因的抑制和促进细胞增殖及侵袭相关基因的激活。此外，PRMT5还靶向许多非组蛋白蛋白，这些蛋白参与了对癌细胞生长和存活至关重要的信号通路。

基于这些发现，PRMT5抑制剂的开发正在进行中，并且在临床试验中已经显示出了有希望的初步结果。在本研究中，我们发现PRMT5和MEP50在CCA中经常过表达，并通过体外和体内实验提供了支持PRMT5抑制对治疗CCA有效的证据。

在人类胆管癌（CCA）组织中，我们首先分析了PRMT5和MEP50的基因表达。在Sia等人的研究中，包括iCCA在内，我们发现与正常胆管（NBDs）相比，PRMT5和MEP50的基因表达显著增加，并且在肿瘤组织中这两个基因的表达水平之间存在直接的正相关关系（图1A）。

此外，我们还发现PRMT5和MEP50的表达与CCA的标志物KRT7呈正相关，而与肿瘤抑制基因SOX17呈负相关（图1A）。在另一组包含eCCA样本的数据中，尽管PRMT5和MEP50的表达与NBDs相比没有统计学上的显著增加，但它们与KRT7、MUC1和EPCAM（对于MEP50）的表达呈正相关，而与SOX17的表达呈负相关（图1B）。我们还发现，PRMT5和MEP50的表达水平在表达更高水平S100P的肿瘤中更高，S100P是一种与iCCA侵袭性相关的标记物（图1C）。

通过免疫组化技术，我们检测了PRMT5和MEP50蛋白的表达。在恶性组织中，包括针刺iCCA活检样本，这两种蛋白的表达水平都很高，定量评估显示，iCCA和eCCA经常过度表达PRMT5和MEP50（图2A）。

在iCCA组织中，PRMT5和MEP50的表达水平也呈现出正相关（图2B）。PRMT5的核定位与其他实体瘤中较差的临床预后有关。我们观察到，在63%的iCCA样本中PRMT5位于细胞的细胞质中，同时也位于细胞核中，而在78%的eCCA样本中也是如此。仅在大约4%的样本中，无论是iCCA还是eCCA，PRMT5仅定位在细胞质中。值得注意的是，PRMT5和MEP50评分较高的iCCA更多地出现在高级别肿瘤中（图2C）。

PRMT5甲基转移酶活性对细胞内甲硫腺苷（MTA）水平高度敏感，MTA是甲硫氨酸代谢途径中的一个代谢产物，也是PRMT5的S-腺苷甲硫氨酸竞争性抑制剂。MTA由广泛存在的酶MTA-磷酸化酶（MTAP）分解，而MTAP基因在实体瘤中经常发生删除。MTAP的缺失导致MTA积累，可能提高靶向PRMT5药物的治疗效能。因此，我们通过免疫组化在CCA组织中评估了MTAP的表达，并发现在25%的iCCA样本中MTAP蛋白无法检测到（图2D和在线补充图1）。这些观察结果强调了PRMT5和MEP50在人类CCA中的频繁过表达与更晚期疾病相关，以及在iCCA中纯合子MTAP缺失是一个相对频繁的事件。

我们通过访问人类CCA细胞系的CRISPR/Cas9 dropout筛选数据，获得了将PRMT5作为CCA治疗靶点的初步证据。我们发现，在83%的CCA细胞系中，PRMT5的遗传失活显著损害了细胞生长，MEP50的观察结果也类似（图3A）。接着，我们测试了两种临床批准的PRMT5药理学抑制剂GSK3326595和JNJ64619178对四种良好特征化的CCA细胞系生长的影响。在所有情况下，GI50值都在低纳摩尔范围内（图3B），这两种药物都显著降低了CCA细胞蛋白提取物中对称二甲基精氨酸（SDMA）的总体水平（图3C）。

MRTX1719是一种小分子，它选择性地结合并抑制与MTA复合的PRMT5。这种药物的开发旨在提高在MTAP缺失癌症中靶向PRMT5的疗效，这些癌症中MTA水平会积聚，从而实现个性化治疗，并可能减少毒性。有趣的是，当我们测试MRTX1719时，发现在MTAP阳性的HuCCT-1细胞中的GI50值比MTAP阴性的TFK-1细胞高（图3D），这与我们对GSK3326595和JNJ64619178的观察结果相反（图3B）。

为了验证这种对MRTX1719的增强反应是否真的可以归因于MTAP状态，我们生成了稳定表达MTAP的TFK-1细胞系。与MTA对PRMT5活性的抑制作用一致，TFK-1-MTAP细胞的基础SDMA水平高于TFK-1-WT（图3D）。重要的是，我们发现TFK-1-WT细胞对MRTX1719的敏感性高于TFK-1-MTAP（图3D），这表明携带MTAP缺失的CCA患者可能从这种个性化治疗中受益。与它们的抗增殖活性一致，PRMT5抑制剂也显著损害了CCA细胞的克隆形成潜力（图3E）。

人们正在积极探索联合策略，以提高基于顺铂和吉西他滨的CCA化疗的疗效。我们测试了GSK3326595和JNJ64619178与顺铂或吉西他滨联合使用的效果，并在大多数剂量组合下在HuCCT-1和TFK-1细胞中发现明显的协同效应（图3F）。

为了进一步检查PRMT5抑制的抗肿瘤效果，我们使用了人类CCA衍生的类器官（tumouroids），它们保留了它们衍生的原始肿瘤的组织学特征、表达谱、基因组景观和肿瘤行为。我们观察到，用GSK3326595处理显著减少了类器官的生长，出现了充满死亡细胞的更小类器官（图4）。总之，这些发现表明PRMT5对CCA细胞生长是必需的，其抑制显著增强了CCA细胞对化疗药物的敏感性。

为了探索PRMT5靶向治疗的抗肿瘤机制，我们对特征明确的HuCCT-1 iCCA细胞进行了转录组分析，以评估JNJ64619178处理的影响。与未处理的对照组相比，我们发现了602个基因表达上调和193个基因表达下调。基因本体生物学过程（GO-BP）功能分类显示，差异表达的基因与肿瘤行为相关，包括细胞周期进展和细胞迁移（图5A）。与PRMT5的生物学功能相符，我们观察到涉及染色质调控、mRNA剪接、DNA修复和DNA损伤反应的基因表达发生了变化。此外，我们还发现与炎症、免疫反应和脂质代谢相关的基因表达显著增加。

PRMT5对于剪接体的组装至关重要，而肿瘤细胞通常依赖于高度活跃的核心剪接机制。为了评估JNJ64619178处理是否影响了剪接，我们分析了RNA测序数据集中的全局替代剪接（AS）变化。我们在编码蛋白的基因中鉴定了1374个AS事件，大多数为跳过外显子和保留内含子（图5B），这两种事件在其他肿瘤类型中已显示出对PRMT5的依赖性。对这些改变的剪接事件进行GO分析，发现在细胞分裂、RNA剪接调控、炎症和代谢途径以及与DNA损伤和修复相关的基因类别中有显著富集（图5C,D）。在这些异常剪接的基因中，我们发现了染色质修饰因子KAT5和KMT5C，它们在DNA损伤反应中起着关键作用，并且在PRMT5敲除的细胞中经历了剪接变化；还有POLD1，它是DNA复制保真性所必需的主要催化DNA聚合酶亚单位，其剪接同样依赖于PRMT5（图5D）。

考虑到PRMT5抑制剂与顺铂和吉西他滨联合使用时表现出的协同效应（图3E），以及它们对参与DNA损伤反应（DDR）的基因表达产生的显著影响，我们通过彗星实验直接测量了DNA链断裂的程度。

正如图7A所示，这项分析发现，经JNJ64619178处理的CCA细胞中DNA断裂的频率有所增加。这种反应还伴随着凋亡的诱导（在线补充图4）。DNA损伤可能是由RNA/DNA杂交结构（即R环）的形成引发的，这种结构导致单链DNA暴露和复制叉进展受阻，从而产生复制压力。通过使用特异性S9.6抗体进行的免疫荧光分析，我们发现PRMT5抑制在HuCCT-1和TFK-1细胞中促进了R环的形成（图7B）。

在DNA受损时，组蛋白2AX（H2AX）会在DNA损伤位点发生磷酸化，并在修复因子的招募中起到关键作用。有趣的是，我们观察到PRMT5抑制显著降低了H2AX蛋白的水平（图7C）。这些发现与PRMT5在维持H2AX蛋白稳定性中的作用相符，这一作用最近在胶质母细胞瘤细胞中已有描述，突显了PRMT5在维持CCA细胞基因组稳定性中的重要作用。

接下来，我们采用了两种不同的PRMT5药理学抑制剂，在两种互补的小鼠CCA模型中评估了PRMT5抑制的抗肿瘤效果。在第一个模型中，肝细胞c-Jun N-terminal kinase 1/2 (Jnk1/2)缺失的小鼠（JnkΔhepa）经过CCl4和DEN处理（JnkΔhepa+CCl4+DEN）会发展出具有与人类iCCA一致的组织学和分子特征的可移植肿瘤，这些肿瘤发生在炎症和纤维化的环境中。因此，在单剂量DEN处理后，8周龄的JnkΔhepa小鼠开始每周接受两次CCl4处理，直到25周龄（JnkΔhepa+DEN+CCl4小鼠）（图8A）。第二组JnkΔhepa+DEN+CCl4小鼠从22周龄开始接受GSK3326595治疗，持续4周，直到25周龄（图8A）。

免疫组化分析显示PRMT5和MEP50在CK19阳性的CCA病变中的表达（图8B）。通过肝脏与体重比（肝脏指数）估计的肿瘤负担，在治疗小鼠中显著减少，肝脏的宏观检查显示结节数量显著减少（图8C）。一致地，组织学分析表明，接受GSK3326595治疗的小鼠显著减少了类似CCA的结构（图8D），这些结构在免疫组化分析中显示出减少的肿瘤细胞增殖（Ki67）、增加的凋亡（裂解的caspase-3）和增加的DNA损伤（p-H2AX）（在线补充图5）。有趣的是，我们在GSK3326595治疗动物的肿瘤区域检测到CD4和CD8 T细胞浸润增加（图8E）。治疗结束时，接受GSK3326595的小鼠体重有所减轻。然而，JnkΔhepa+DEN+CCl4小鼠中显著增加的肝脏酶血清水平，在GSK3326595治疗下显著降低（图8F）。

在第二个与临床相关的小鼠iCCA模型中，我们评估了PRMT5抑制剂对肿瘤发展的抑制作用。该模型通过在肝细胞中表达激活形式的TAZ和AKT来诱导HTVI27（见图9A）。在这种情况下，极具侵袭性的肿瘤在注射致癌基因后迅速生长，到了第10周，大部分正常肝组织被肿瘤取代，导致小鼠死亡。在HTVI后2周，PRMT5和MEP50在早期的病变中已被清晰检测到，并且在1周后发现的肿瘤中显著过表达（见图9A）。

接下来，我们探究了PRMT5抑制对iCCA发展的影响。我们给注射了TAZ和AKT质粒的小鼠施用JNJ64619178或载体，治疗持续到HTVI后3周（见图9A）。JNJ64619178治疗的耐受性良好，根据血清转氨酶水平，它还显著减轻了肝损伤（见图9B）。治疗结束时，与对照TAZ-AKT小鼠中观察到的广泛宏观肿瘤病变相比，接受JNJ64619178治疗的小鼠中这些病变不太明显。肝脏指数证实了肿瘤负担的显著减少（见图9C）。组织学分析也显示，接受PRMT5抑制剂治疗的小鼠肿瘤病变面积显著减少（见图9D）。这些病变中肿瘤细胞的增殖减少了（Ki67），凋亡增加了（裂解的caspase-3），DNA损伤也增加了（p-H2AX）（见在线补充图6）。

正如在JnkΔhepa+DEN+CCl4模型中观察到的，与TAZ-AKT对照小鼠相比，在接受JNJ64619178治疗的小鼠的肿瘤区域中，CD4和CD8 T细胞的浸润明显增加（见图9E）。为了更深入地理解PRMT5抑制在该模型中的抗肿瘤机制，我们对用JNJ64619178或载体治疗的TAZ-AKT小鼠的肝脏组织进行了转录组分析。差异表达基因的功能分类揭示了与细胞增殖和细胞周期进展相关的基因类别，这与观察到的抗肿瘤效果一致（见图9F）。

有趣的是，脂质代谢相关基因的表达也受到了影响，这可能与PRMT5在肝脂肪代谢中的作用相符。与我们的体外发现一致，PRMT5的靶向显著影响了与免疫和炎症反应、mRNA剪接和DDR相关的基因类别（见图9F）。值得注意的是，异常的TAZ/YAP表达如何通过促进DNA损伤和染色体不稳定性来促进人类CCA的发展。与这项人类研究一致，我们发现在TAZ-AKT小鼠的肝脏中，多个关键DDR基因（BRCA1、BRCA2、RAD51、POLD1、HELLS）的表达被诱导，而JNJ64619178治疗减弱了这种反应（见图9G）。最后，值得注意的是，在两种小鼠CCA模型中，MTAP的表达都得到了保留（见在线补充图7）。

图9 PRMT5抑制剂在由水动力尾静脉注射（HTVI）激活形式的TAZ和AKT引发的侵袭性胆管癌（CCA）模型中的抗肿瘤效果。

(A) 图表展示了TAZ-AKT模型及所采用的治疗方法（每组6只小鼠）。下方显示了在注射质粒后2周和3周，TAZ-AKT小鼠中发展出的病变中PRMT5和MEP50的免疫组化分析的代表性图片，同时还展示了TAZ和p-AKT（Ser473）的表达情况。

(B) 不同组小鼠血清中的转氨酶（AST和ALT）水平。(C) 图表显示了以肝脏与体重比（肝脏指数）估计的肿瘤负担，以及对照组、TAZ-AKT小鼠和经JNJ64619178处理的TAZ-AKT小鼠肝脏的代表性宏观图片。(D) 代表性的H&E染色肝组织切片，展示了TAZ-AKT和经JNJ64619178处理的TAZ-AKT小鼠中CCA病变的程度。图表显示了肿瘤区域的量化数据。

(E) 展示免疫组化检测CD4和CD8 T细胞的代表性图片，以及对照组TAZ-AKT和经JNJ64619178处理的TAZ-AKT小鼠中肿瘤浸润的CD8和CD4 T细胞（黄色箭头）的量化数据。(F) 通过基因本体生物学过程（GO-BP）功能分类，从TAZ-AKT和经JNJ64619178处理的TAZ-AKT小鼠肝脏的转录组数据中鉴定的差异表达基因的最相关类别。(G) 对照组、TAZ-AKT和经JNJ64619178处理的TAZ-AKT小鼠肝脏中DNA损伤反应（DDR）相关基因表达的qPCR分析结果。

胆管癌（CCA）患者急需开发新的治疗方法，尤其是那些能够与化疗或免疫疗法相结合的策略。我们的研究提供了证据，支持PRMT5这种精氨酸甲基转移酶可能是针对这种高度侵袭性癌症的系统治疗新靶点。尽管PRMT5基因突变在肿瘤中不常见，但该基因的过度表达在多种恶性肿瘤中常有发现。我们发现，在不同解剖起源的CCA中，PRMT5及其功能伙伴MEP50的表达与疾病的晚期阶段显著相关。以往的实验研究已经表明，PRMT5的高表达水平直接推动了肿瘤的恶性进展，因此不应仅将其视为与癌症相关的伴随现象。

从治疗的角度来看，至关重要的一点是，遗传和药理学的研究已经证明，癌细胞所需的PRMT5活性是正常细胞的2到5倍，而正常细胞即使在PRMT5活性仅剩15%到20%的情况下也能存活。因此，目前有多项临床试验正在评估PRMT5小分子抑制剂在实体瘤和血液恶性肿瘤治疗中的应用。

有趣的是，先前的研究表明，缺失MTAP基因的癌细胞对PRMT5抑制剂更加敏感，这是因为缺少MTAP的细胞会积累MTA这种代谢物，它是PRMT5的内源性抑制剂，通常由MTAP分解。在多种实体恶性肿瘤中已经观察到MTAP的纯合子缺失，最近对胃肠道癌症进行的基因组研究发现，大约15%的iCCAs出现了MTAP缺失。我们的免疫组化分析也证实，在超过20%的iCCAs中MTAP蛋白的表达发生了丢失，尽管需要更多样本的研究来确定eCCAs中MTAP丢失的具体频率。然而，我们已经展示了可以通过常规的免疫组化染色（IHC）轻松地在CCA组织样本中检测MTAP的状态。这可能有助于指导临床选择，预测哪些患者可能对基于PRMT5抑制剂的治疗方案有更好的反应，尤其是针对像MRTX171924这样的分子。

原始出处：

Elurbide J, Colyn L, Latasa MU, Uriarte I, Mariani S, Lopez-Pascual A, Valbuena E, Castello-Uribe B, Arnes-Benito R, Adan-Villaescusa E, Martinez-Perez LA, Azkargorta M, Elortza F, Wu H, Krawczyk M, Schneider KM, Sangro B, Aldrighetti L, Ratti F, Casadei Gardini A, Marin JJG, Amat I, Urman JM, Arechederra M, Martinez-Chantar ML, Trautwein C, Huch M, Cubero FJ, Berasain C, G Fernandez-Barrena M, Avila MA.Identification of PRMT5 as a therapeutic target in cholangiocarcinoma.Gut. 2024 Sep 11:gutjnl-2024-332998. doi: 10.1136/gutjnl-2024-332998