西安电子科技大学王忠良、张象涵团队Nano Letters：绕过Ca2+内流：核靶向近红外花菁光敏剂在抗转移光动力治疗中的应用

近日，西安电子科技大学生命科学技术学院王忠良教授、张象涵副教授在国际综合类顶级期刊《Nano Letters》，发表了题为“Bypassing Ca²⁺ Influx for Antimetastasis Photodynamic Therapy via Robust Nucleus-Targeted Near-Infrared Cyanine”的研究论文（DOI: 10.1021/acs.nanolett.4c04789）。该研究提出了一种创新的光动力疗法，开发了具有核靶向能力的近红外（NIR）花菁光敏剂，在光动力治疗原发肿瘤的同事能有效抑制肿瘤的转移，为PDT癌症治疗领域带来了新的策略。论文第一单位为西安电子科技大学，生命科学技术学院张象涵副教授为论文的第一作者，杨鹏博士、夏玉琼副教授和王忠良教授为论文的共同通讯作者。

癌症转移是导致癌症患者死亡的主要原因之一，而缺氧环境是这一过程的关键诱导因素。乏氧诱导因子（HIF-1α）促进癌细胞对缺氧的适应，并作为促进转移的关键微环境因子。光动力疗法（PDT）作为一种新兴的治疗手段，在局部精准肿瘤治疗中展现出巨大潜力。然而，的氧依赖性可加剧肿瘤缺氧，进而上调HIF-1α及其下游信号通路，促进肿瘤转移，这成为PDT治疗的一大挑战。当前研究策略主要集中在缓解HIF-1α通路，但迫切需要创新的PDT方法从光敏剂源头预防转移。研究表明，传统的PDT会触发细胞质内Ca²⁺水平升高，进而激活HIF-1α，而降低Ca²⁺水平则可以抑制肿瘤转移。钙离子作为细胞内重要的信使，在HIF-1α的生命周期中发挥重要作用，从其转录到降解，从而影响HIF-1α的活性。

在PDT治疗中，传统的PSs如Ce6主要靶向线粒体，可实现PDT对原发肿瘤的高效治疗；然而，由于线粒体也是Ca²⁺存储和调控的关键枢纽，同时也会因ROS诱导细胞质Ca²⁺水平的提高，从而增强HIF-1α活性，恶化肿瘤转移。Ce6作为典型线粒体靶向PS，在激光照射后，在 Ce6 组（称为 Ce6-PDT）的细胞质内观察到Ca²⁺荧光增加了 3 倍（图 1b 和 c），HIF-1α 的活性和稳定性也随之增加（图 1d 和 e）。我们推测PDT 产生的 ROS 升高诱导Ca ²⁺从线粒体泄漏。研究人员采用钙螯合剂 BAPTA-AM联合Ce6治疗（简称 Ce6-B），降低细胞质钙离子含量同时，降低了 HIF-1α表达及活性，表明细胞内Ca²⁺水平与HIF-1α活性存在显著相关性。为了进一步评估 Ca²⁺抑制可减少线粒体靶向 PDT 后的肿瘤转移，4T1荷瘤小鼠在用 Ce6-PDT 或 Ce6-B-PDT （Ce6 + BAPTA-AM + 激光;图 1g）治疗 20 天后，肺组织的H&E染色表明 Ce6-B-PDT 组表现出相当大的抑制肿瘤转移效果（图 1h）。

图1    抑制Ca²⁺减少线粒体靶向PDT引起的转移

为此，研究团队提出通过精确的细胞核靶向光敏剂（PSs）来解决PDT引起的转移问题。受经典核靶向TO探针结构的启发，通过将喹啉和苯并噻唑杂环引入花菁染料结构中，设计合成了两种核靶向光敏剂TP和QP（图2a）。首先利用分子对接的方法研究了DNA与三种PSs（Ce6、QP和TP）之间的结合能。TP和QP的吉布斯自由能较低（分别为- 60.54和- 52.01 kcal/mol），而Ce6的吉布斯自由能最高（2.31 kcal/mol），说明TP和QP具有较强的DNA结合能力（图2b）。随着DNA浓度的增加，TP和QP的荧光增强进一步证实了TP和QP都可以很容易地锚定DNA。这些共轭的PSs可以吸收660 nm的光，并特定地靶向细胞核（图2c-e）。

图2   细胞核靶向近红外花菁光敏剂的设计和表征

在细胞水平，这些核靶向光敏剂能够有效抑制细胞质内Ca²⁺水平的升高，并抑制HIF-1α的活性（图3c-i）。4T1细胞中Ca²⁺含量和 HIF-1α 相对表达之间成正相关，相关系数（R）为 0.81（图3m）。这些结果表明，该核靶向PDT方法巧妙地绕过了Ca²⁺通道，避免了因Ca²⁺大量涌入细胞内而引发HIF-1α活性升高，打破传统 PDT耗氧引发 HIF-1α活性升高所导致的转移问题，提高了抗肿瘤转移治疗的有效性（图3a）。

图3  细胞核靶向PDT绕过Ca²⁺内流并抑制HIF-1α活性

进一步验证细胞核靶向光敏剂的体外杀伤能力和抗转移能力，电子自旋共振（ESR） 分析表明PS 在激光照射下产生¹O₂（图 4a）。TP和QP组的的 ROS 量子产率分别约为 0.42 和 0.51（Ce6的 ROS 量子产率约0.64）（图 4b）。研究人员使用钙黄绿素-AM 和碘化丙啶的双重染色评估 PSs 的体外肿瘤细胞杀伤效率，Ce6 和 QP 组表现出比 TP 组更高的杀伤效果（图4e）。进一步，流式细胞术分析表明PDT治疗通过产生ROS诱导肿瘤细胞凋亡（Q2，早期细胞凋亡，Q3，晚期细胞凋亡）和坏死（Q1）（图 4f 和 4g）。

细胞伤口划痕实验显示，在光照后TP-PDT 和 QP-PDT 都显著抑制了细胞迁移（图 4i），Ce6-PDT 组细胞的迁移率为 35%，而 TP-PDT 和 QP-PDT 组的迁移率显著降低，分别为 17% 和 14%（图 4j），约为 Ce6-PDT 组的 1/2，尽管 Ce6 具有更高的 ROS 生成能力（图 4b，c）。这表明核靶向的 PS（TP 和 QP）比线粒体靶向的PS（Ce6）具有更强的抑制细胞迁移能力。随后，使用Transwell实验显示，与 Ce6-PDT 相比，TP-PDT 和 QP-PDT组细胞迁移能力降低（图 4k-l），这表明细胞核靶向 PDT 在降低肿瘤细胞的侵袭能力比线粒体靶向PDT更有效。总的来说，这些结果表明，细胞核靶向PDT可以显著减少癌细胞迁移和侵袭。

图4  核靶向PDT的体外抗转移能力

最后，研究人员在 4T1 荷瘤小鼠上评估了细胞核靶向 PDT 的体内抗转移能力（图 5a）。Ce6、TP 和QP治疗组20天后，所有原发性肿瘤均被完全抑制（图 5b）。随后，研究人员对肺组织并进行了转移评估，结果显示TP-PDT 和 QP-PDT所导致的肺转移可忽略不计，而Ce6-PDT 组观察到明显的转移结节（图 5c-5e）。值得注意的是，钙离子抑制剂联合Ce6组（Ce6-B-PDT）表现出对肿瘤转移的显著抑制。同时PDT 治疗后 24 小时原发肿瘤组织中的 HIF-1α和Ca²⁺进行染色结果也显示，与 Ce6-PDT 组相比，Ce6-B-PDT、TP-PDT 和 QP-PDT 组的Ca²⁺含量和 HIF-1α 绿色荧光信号明显降低。进一步证实了破坏Ca²⁺– HIF-1α 相互作用可有效减少PDT触发的转移。此外，观察到肺转移百分比与Ca²⁺和HIF-1α水平呈正相关（图 5i）。这些发现不仅证实了细胞核靶向 PDT 的卓越抗转移功效，而且还揭示了Ca²⁺ Ca²⁺水平和PDT 后的抗转移作用之间的关系。

图5 核靶向PDT的体内抗转移能力

【结论与展望】

总的来说，在这项研究中，研究人员证明了传统线粒体靶向PDT触发了细胞质Ca²⁺水平的增加，激活HIF-1α并增强了转移。基于Ca²⁺在细胞质中的储存和调节作用，研究人员提出精准核靶向光敏剂从源头解决PDT诱导的转移。随后，设计了两种具有细胞核靶向能力的NIR花菁PSs，可绕过Ca²⁺泄露，有效降低HIF-1α活性，从而在4T1肿瘤中取得优异的PDT抗转移效果。该研究不仅为打破Ca²⁺−HIF-1α相互作用以防止肿瘤转移提供了新的见解，而且从PDT治疗源头提供了一种新型核靶向PSs来规避转移的有效方法。

【文献详情】

X. Zhang, H. Zhang, Q. Dong, Y. Qin, Y. Cao, H. Zhu, Z. Ma, Z. Li, Z. Rao, P. Ning, Z. Tian, Y. Xia, P. Yang, Z. Wang. Bypassing Ca²⁺  Influx for Antimetastasis Photodynamic Therapy via Robust Nucleus-Targeted Near-Infrared Cyanines. Nano Lett., 2024, DOI: https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.4c04789

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