空军军医大学张瑞教授/西北大学武国军教授Biomaterials：前列腺癌免疫治疗的曙光 ！

前列腺癌 (PCa) 表现为一种“冷”肿瘤，由于其肿瘤突变负荷低、程序性细胞死亡蛋白配体1(PD‐L1) 表达受限和 T 细胞浸润减少，其特征是对免疫治疗的反应性欠佳。因此，新的、更有效的免疫疗法对于改善前列腺癌患者的预后具有重要意义。

近期，空军军医大学基础医学院免疫学教研室张瑞团队/西北大学附属人民医院泌尿外科武国军团队于国际医学研究期刊Biomaterials杂志在线发表题为：“Genetically modified extracellular vesicles loaded with activated gasdermin D potentially inhibit prostate-specific membrane antigen-positive prostate carcinoma growth and enhance immunotherapy”的研究论文。该研究利用基因工程重组胞外囊泡 (EV) 在其表面表达与前列腺特异性膜抗原 (PSMA) 高亲和力的单链可变抗体片段 (scFv)，并负载 gasdermin D 的 N 端结构域(GSDMD)，构建了一种特异性靶向PSMA阳性前列腺癌的递送平台（PSMA_scFv-EV^N-GSDMD）。该平台可以直接引发PSMA 阳性 PCa 细胞的焦亡，导致肿瘤生长抑制和抗肿瘤免疫反应激活。该研究为前列腺癌的免疫治疗带来了新的曙光。

在本研究中，最为重要的是PSMA_scFv-EV^N-GSDMD靶向性和效应性的验证。鉴于此，研究者通过流式细胞术和共聚焦显微镜评估了前列腺癌 22RV1 (PSMA+ ）和 PC3（PSMA -) 细胞与 PKH67 标记的 PSMA_scFv-EV 的结合率，发现PSMA_scFv-EV在 PSMA 阳性的22RV1细胞中表现出比 PSMA 阴性的 PC3 细胞更高的靶向效率和细胞摄取能力，突出了其作为递送系统的潜力（图1）。另外，研究者评估了 PSMA_scFv-EVs 在体内特异性靶向 PSMA 阳性 PCa 细胞的潜力。首先，研究者对22RV1 荷瘤小鼠尾静脉给予200 μg DiD标记的Ctrl‐EVs和PSMA_scFv-EVs，小动物活体成像系统测量给药后3h和 12 h 的荧光信号强度。随后发现在给药后3 h，PSMA_scFv-EV处理的小鼠表现出比Ctrl-EV处理的小鼠更强的荧光信号。同样，离体器官成像也证明了，与Ctrl-EV处理的小鼠相比，PSMA_scFv-EV处理的小鼠肿瘤组织中 DiD 标记的 PSMA_scFv-EV 积累增加。相比之下，脾、肾、脑、肠管未见此类信号差异（图2）。

图1. PSMA_scFv-EV的体外靶向研究

图2. PSMA_scFv-EV的体内肿瘤靶向能力

为了评估 PSMA_scFv-EV 将生物活性药物递送至 PCa 治疗靶细胞的有效性。研究者将合成的pcDNA 3.1(+)-N-GSDMD质粒随后装载至PSMA_scFv-EVs 中。首先，研究者评价了 EV 中的pcDNA 3.1(+)-N-GSDMD含量。随后，研究者将 22RV1 细胞与 PSMA_scFv-EV ^N-GSDMD 共孵育，24 h后观察到PSMA_scFv-EV ^N-GSDMD 组中存在大量焦亡细胞。RT-qPCR结果证明 N-GSDMD 被高效包裹在PSMA_scFv-EVs 中；Western blotting结果表明递送的 N-GSDMD 可以成功表达，并诱导受体细胞焦亡。此外，研究者发现 12 h 时可见明显的细胞肿胀、质膜气泡生成等焦亡特征，24 h细胞有爆裂趋势。为了进一步验证PSMA_scFv-EV ^N-GSDMD 诱导焦亡的发生，研究者评价了不同组处理后 22RV1 肿瘤细胞中乳酸脱氢酶 (LDH) 的释放和细胞因子白细胞介素 (IL)1β的表达水平。结果表明PSMA_scFv-EV ^N-GSDMD 组中LDH释放含量和IL-1β的表达水平最高（图3）。

接下来，研究者通过 CCK-8 实验分析了 PSMA_scFv-EV ^N-GSDMD 抑制细胞增殖能力。结果表明24 h后 PSMA_scFv-EV ^N-GSDMD 显著抑制 22RV1 细胞增殖。相反，Ctrl-EV和 PSMA_scFv-EV 组细胞生长未见明显抑制，这说明EVs 本身不具有毒性。随后，研究者使用流式细胞术定量PSMA_scFv-EV ^N-GSDMD 在 PCa 细胞中的致死效应，发现随着PSMA_scFv-EV ^N-GSDMD 处理时间的延长，双阳性细胞（焦亡细胞）百分比显著增加。综上所述，这些发现证实 N-GSDMD 成功地包裹在PSMA_scFv-EV 内，PSMA_scFv-EV ^N-GSDMD在体外表现出显著的抗癌活性（图3）。

图3. PSMA_scFv-EV^N-GSDMD 的表征和焦亡作用

研究者进一步评估了PSMA_scFv-EV^N-GSDMD 体内抗肿瘤疗效。结果证明，与对照处理相比，PSMA_scFv-EV ^N-GSDMD显著抑制了22RV1 异种移植裸鼠肿瘤生长，表现为肿瘤体积和重量的减小。HE 染色和 TUNEL 凋亡检测分析证明，与对照组相比，PSMA_scFv-EV ^N-GSDMD显著诱导肿瘤组织发生坏死，并释放大量的IL-1β和IL18焦亡因子（图4）。

图4. PSMA_scFv-EV ^N-GSDMD 在 PCa 异种移植小鼠模型中的抗肿瘤疗效

为进一步证明 PSMA_scFv-EV ^N-GSDMD 能协同增强PD1抑制剂抗肿瘤免疫反应，研究者构建了双侧RM-1-PSMA+ C57BL/6小鼠荷瘤模型。瘤内注射治疗完   

成后，发现治疗侧和未治疗侧的肿瘤大小均显著减小，aPD-1联用PSMA_scFv-EV^N-GSDMD的治疗效果最显著。此外，荷瘤小鼠未观察到体重减轻，表明PSMA_scFv-EV ^N-GSDMD 无明显副作用。另外，肿瘤组织中IL-1β、IL-18和干扰素 (IFN)-γ的细胞因子释放也显著增加（图5）。

最后，研究者分析了 PSMA_scFv-EV ^N-GSDMD在体内引起的局部和全身免疫反应。通过流式细胞术和免疫荧光 (IF) 染色，分析肿瘤和肿瘤引流淋巴结 (TDLNs) 内多个免疫细胞的浸润情况。结果证明PSMA_scFv-EV ^N-GSDMD 治疗组和aPD-1 + PSMA_scFv-EV ^N-GSDMD治疗组的CD3 ⁺ CD8 ⁺ T细胞和GZMB ⁺ CD8 ⁺ T细胞的比例明显高于对照组（图6）。此外，PD-1 ⁺ CD8 ⁺ T细胞的比例在治疗组小鼠中显著低于对照组小鼠。相比之下，肿瘤内可见免疫调节 T 细胞 (Tregs) 数量明显下降。另外，用 PSMA_scFv-EV ^N-GSDMD 和aPD-1 + PSMA_scFv-EV ^N-GSDMD处理的小鼠肿瘤未处理侧的CD3 ⁺ CD8 ⁺ T细胞比例显著高于肿瘤处理侧，可能是由于 PSMA_scFv-EV ^N-GSDMD 诱导的强效全身抗肿瘤免疫激活。这一结果证实了 PSMA_scFv-EV ^N-GSDMD 能够刺激远处肿瘤的免疫治疗反应，表明其对转移性前列腺癌治疗的潜在适用性（图6）。此外，研究者评估了免疫原性细胞死亡（ICD）生物标志物（CRT和HMGB1）和焦亡分泌细胞因子（IL-1β和IL-18）的表达。结果证明，RM-1-PSMA双荷瘤小鼠肿瘤组织和血清CRT、HMGB1和 IL-18 水平显著高于对照组小鼠（图7）。总之，PSMA_scFv-EV ^N-GSDMD不仅触发了肿瘤内的炎性焦亡而且重塑了免疫抑制性TME，导致全身抗肿瘤免疫反应的激活，从而有效地抑制了肿瘤进展。

图5. PSMA_scFv-EV ^N-GSDMD 通过增强免疫反应在双肿瘤小鼠模型中的肿瘤生长抑制作用

图6. PSMA_scFv-EV ^N-GSDMD 通过系统免疫促进TME重塑

图7. PSMA_scFv-EV ^N-GSDMD 通过 ICD 诱导的免疫应答激活和 Treg 诱导抑制

【文章结论与讨论，启发与展望】

本研究建立了基于HEK-293T EV的靶向递送平台PSMA_scFv-EV ^N-GSDMD，并提出了一种可行的 EV 工程策略，特异性诱导肿瘤细胞焦亡，从而引发强效的抗肿瘤免疫反应。重要的是，PSMA_scFv-EV ^N-GSDMD治疗在 22RV1 异种移植荷瘤小鼠和 RM-1-PSMA 双荷瘤小鼠中导致显著的肿瘤抑制，不良反应较小。总之，该研究构建了基于工程 EVs 诱导焦亡用于协调增强前列腺癌免疫治疗的潜在有效策略。

空军军医大学基础医学院免疫学教研室张瑞教授/西北大学武国军教授为该论文的共同通讯作者，高科、席文锦和倪建鑫为本论文的共同第一作者。本研究受到国家自然科学基金、陕西省杰出青年基金、陕西省重点科技创新研究团队；陕西省重点产业创新链项目、陕西省自然科学基础研究重点项目和西安市人民医院（西安市第四医院）研究孵化基金等项目资助。

原文链接：

https://www.sciencedirect.com/unsupported_browser