Cancer Cell｜肿瘤耐药研究又有新进展！“基因突变”或许不是必要条件

临床上，通过化疗的癌症患者，通常都会有一段时间的缓解期，遗憾的是，在缓解期后，病情往往会出现进展，并且复发的肿瘤细胞还将出现对原有化疗药物的耐药现象。

解释耐药现象出现的原因，一直是科学家不断探索的领域。近期，在Science杂志上发布的一篇研究认为，临床上使用放化疗药物抵抗癌症进展时，机体内的肿瘤细胞往往通过应激诱导的突变(stress-inducedmutagenesis，SIM)这一机制，发展出耐药的细胞株，使得肿瘤复发…

然而，也有很多科学家认为，基因突变并不能完全解释肿瘤细胞出现耐药这一现象，越来越多的研究聚焦于细胞的非遗传改变1。有研究表明，肿瘤细胞产生抗药性的机制之一，就是改变其表型特征。对激素治疗敏感的前列腺癌细胞，可转变为不依赖激素生长的细胞类型，从而躲避药物的杀伤！

2020年7月27日，美国斯隆·凯特琳癌症中心、哈佛大学和麻省理工学院科学家联合在CancerCell上发表了一篇名为“Emergenceof a High-Plasticity Cell State during Lung CancerEvolution”的文章。文中研究了肿瘤细胞一种特殊的状态——高可塑性细胞状态（high-plasticitycell state,HPCS）在肿瘤发生发展过程中的关键作用。本研究使用肿瘤前增生到腺癌七个阶段的基因工程小鼠模型，研究肺腺癌（lungadenocarcinoma ,LUAD）单细胞转录组的改变，发现小鼠肿瘤和异种移植的患者中分离的肿瘤细胞都存在HPCS，同时具有高分化和增殖能力。并通过进一步的实验发现HPCS具有高致瘤能力和耐药性，且与患者预后不良相关联。值得注意的是，肿瘤细胞异质性*的出现和维持也是由HPCS驱动的。该研究为肿瘤异质性的研究和未来以HPCS为靶向治疗提供了指导和借鉴2。

*肿瘤的异质性是恶性肿瘤的特征之一，是指肿瘤在生长过程中，经过多次分裂增殖，其子细胞呈现出分子生物学或基因方面的改变，从而使肿瘤的生长速度、侵袭能力、对药物的敏感性、预后等各方面产生差异。

图1:https://doi.org/10.1016/j.ccell.2020.06.012

肿瘤中，每个癌细胞的表型或状态受到多种细胞内在和细胞外在因素的影响，肿瘤细胞状态多样性的改变也是癌症治疗面临的挑战之一。在过去的30年里，一些常见癌症共有的基因表达谱已经被详细地描述出来，并且已经建立了部分小鼠和人类晚期肿瘤的表达谱。然而，在分子水平上，肿瘤细胞发展过程呈现的多样性改变，同时在一定的遗传背景下，为何这种多样性改变能重复出现？同一肿瘤的不同细胞状态之间是否存在关联、支持或是竞争？以及在驱动肿瘤进展过程中，细胞状态的改变又在其中扮演了什么样的角色？这些疑问还尚未明了。

表型多样性显着增加以及可再现是LUAD进展的特征

肺腺癌（LUAD）主要起源于2型肺泡（AT2）细胞。研究人员首先通过基因工程的方法，构建了小鼠的LUAD模型（Geneticallyengineered mouse models，GEMM），重现了肿瘤前状态到肺腺癌恶性改变的8个不同的状态点。通过收集39只小鼠的LUAD进化的3,891个高质量的全长单细胞转录组，通过RNA-seq研究各个状态点，肿瘤分子水平的多样性改变。

结果显示，随着肿瘤的发展，细胞表型异质性增加，晚期多样性增加，发展为大量不同的簇，表达模式也更加多样化。同时，这些改变在小鼠体内和小鼠间的肿瘤之间具有显著的可重复性，并且与每个肿瘤的组织病理学进展一致。晚期腺癌包含簇10、11和12，除了在肿瘤起始阶段检测到的所有细胞状态外，还包括在正常AT2细胞和早期肿瘤中发现的早期细胞状态。此外，大多数癌细胞表型在30周时出现在每一个单独的KP型肿瘤（致癌基因KRAS-G12D活化型）中。值得注意的是，在小鼠和单个肿瘤中从腺瘤阶段开始分析的每个样本中都有簇5和9细胞。因此，在这个动物模型中，肿瘤经历了一个相对有序和可复制的多样性的转录状态。

图2:小鼠LUAD模型——RNA-seq

肿瘤细胞表型多样性或与基因突变无关

先前的研究表明，LUAD肿瘤突变主要由染色体拷贝数的改变导致的，同时肿瘤不发生复发性点突变。因此，研究人体在实验中，通过每个细胞的scRNA-seq谱推断出染色体拷贝数变化(CNVs)。与KT（p53基因突变型）肿瘤相比，KPT细胞在相应的时间点具有更多的CNVs。在30周KPT肿瘤的一个亚群中，研究人员通过单个肿瘤细胞的全基因组测序(scDNA-seq)来估计DNA拷贝数。小鼠肿瘤中显著共享的CNVs，均来自同一个克隆群。同时，具有高度相似CNV模式的细胞竟属于多个不同的转录簇，而具有不同克隆型CNVs的细胞却属于同一转录簇。这些结果表明KP肿瘤中大量的表型异质性是可重复获得的，但这不仅仅是基因CNV变化的结果。

图3:肿瘤细胞表型多样性与CNV变化无关

LUAD进展过程中出现了一个“高度混合的状态”

研究人员紧接着分析LUAD细胞的表型变化特征，发现进展过程中，肿瘤肺泡细胞表型的丧失，出现肺祖细胞、胚胎内胚层和上皮间充质转化（EMT）相关的特征。这表明在肿瘤进化连续体中，细胞处于一个动态，因此研究人员接下来使用非负矩阵分解（NMF）探索了转录程序和细胞状态转换的连续变化。

通过实验发现了11个转录程序，其中5个特别强调了肿瘤进展过程中，连续的表型变化。而这5个中，有3个在LUAD发展开始时，胚胎样程序和EMT程序后期，出现的与AT2细胞特征相关的程序。同时，实验中也发现了两个之前未知的细胞程序，混合AT1和AT2细胞特征的一个早期程序(混合AT1/AT2状态)和另一个与明确的细胞识别程序不匹配的程序(高度混合状态)。通过进行免疫染色标记发现，发现检测到细胞共同表达一个混合程序的标记，这表明这些细胞可能正在从一种状态过渡到另一种状态。

图4：肿瘤细胞表型转变时，同时出一个“混合状态”

“高度混合的状态”中的细胞可标记出一个高度可塑性单元（即HPCS），从而形成一个过渡点

研究人员首先发现，转录簇5出现的时间、在高度混合程序中的表达以及在肿瘤中特殊的持久性，认为簇5与HPCS之间的存在可能的相关性。通过转座酶可及染色质测序，对簇5阳性细胞进行单细胞分析。结果表明，肿瘤细胞对簇5特征的基因的可接近性增加。进一步的研究发现RUNX2是原发肿瘤转移表型的驱动因素，而通过Jak/Stat途径的CD109信号活性已被证明与这种表型有关。与此同时，发现CD109标记了簇11与EMT有关。因此，上述的研究表明，HPCS可能是获得原发肿瘤转移能力的EMT状态的前体。

图5:具有明显的染色质可及性特征的高度可塑性细胞状态的鉴定

HPCS并不是干细胞特征，且存在于人类肿瘤细胞中

最后，对不同的人LUAD组织进行免疫染色，也同样发现在小鼠模型中观察到的细胞过渡状态。此外，对LUAD肿瘤中的恶性细胞scRNA-seq谱进行了分析显示细胞的HPCS状态存在于每一个肿瘤细胞中。在对癌症基因组图谱的(TCGA)的RNA-seqRNA分析发现，LUAD肿瘤表达HPCS与EMT、较差的生存率相关。通过对整合素α2Hi人LUAD细胞的特征进行分析发现，整合素α2Hi肿瘤细胞与整合素α2Lo细胞相比，从三个独立的患者来源的异种移植瘤模型中分离得到的整合素α2Hi肿瘤细胞形成的肿瘤球明显更多。且基于液滴的scRNA-seq分析表明，整合素a2Hi人LUAD细胞比整合素α2Lo大块肿瘤的转录多样性更高。综上所述，这些结果表明HPCS样状态也存在于人类LUAD中，并可能在临床中作为肿瘤进展和耐药性的驱动和生物标志物具有重要意义。

图6:人LUAD细胞测序分析

文章小结

综上所述，在LUAD小鼠模型和人肿瘤中，转录异质性的增加及遗传的不确定性和可塑性是肿瘤发展的重要特征。HPCS除了反映肺和其他上皮细胞状态的程序外，还与化疗耐药性、高增长潜力和患者的低存活率相关，是肿瘤发展和肿瘤内异质性的关键驱动因素，可能为未来的肿瘤治疗提供重要的靶标。

作者寄语

HPCS的应用——改变耐药性

尽管，许多先前的研究都在寻找肿瘤的“抗药性突变”，即导致肿瘤抵抗癌症药物作用的基因改变。但是，突变后如何抵抗药物的作用机制仍是一道未知题。该文作者Chan博士认为，这个新发现为该谜题提供了一种可能的答案。

Chan博士说：“我们的模型可以解释为什么某些癌细胞对治疗有抗性，同时HPCS是肿瘤细胞状态的呈现形式，更具可塑性、延展性。“

因此，Chan博士认为，将化疗药物与针对这些高度可塑性细胞的新药物相结合，或可避免耐药性的出现并提供更长的持续缓解期。

参考文献：

1  Lawson,D. A., Kessenbrock, K., Davis, R. T., Pervolarakis, N. & Werb, Z.Tumour heterogeneity and metastasis at single-cell resolution. NatureCell Biology 20, 1349-1360, doi:10.1038/s41556-018-0236-7(2018).

2  Marjanovic,N. D. et al. Emergence of a High-Plasticity Cell State duringLung Cancer Evolution. Cancer Cell,doi:https://doi.org/10.1016/j.ccell.2020.06.012(2020).