Cancer Cell：提高 CAR-T 疗效的新思路：调节肌酐代谢通路

CAR-T细胞疗法是一种将嵌合抗原受体(CAR)导入T细胞，使T细胞获得特异性识别和杀伤肿瘤细胞的能力的技术。腺苷(Ado)是一种免疫抑制性核苷，在肿瘤微环境中起着重要作用。CD39和CD73是Ado生成的关键酶。过去的研究表明功能衰竭的CAR-T细胞表面表达CD39和CD73,可以通过生成Ado来介导免疫抑制。但是如何防止Ado介导的免疫抑制，从而提高CAR-T细胞的功效，仍有待探寻。

近日，由斯坦福大学医学院 Crystal L. Mackall 团队发表于 Cancer Cell 的题为Inosine induces stemness features in CAR-T cells and enhances potency 的文章，发现通过直接补充或过表达腺苷脱氨酶，可增加肌苷（INO）水平，从而增强CAR-T细胞的功能和干性。

首先，CD39是CAR-T细胞功能减弱的标志。大量耗竭的CD39+ CAR-T细胞共表达CD73，产生腺苷(Ado)并通过A2aR介导免疫抑制。而腺苷脱氨酶(ADA)可将腺苷(Ado)分解为肌苷（INO），从而减少Ado介导的免疫抑制。为此，研究设置了ADA过表达的实验组(ADA-OE)。针对转录组学和表型特征的研究发现，腺苷脱氨酶的过表达(ADA-OE)增加了CAR-T细胞的干性特征，降低了终末分化。

与对照组相比，ADA-OE诱导与干性相关的基因上调，与效应功能相关的基因和耗竭相关的基因下调。

接着，在体外实验中，为了测试肌苷（INO）是否可以调节慢性活化CAR-T细胞的干性，研究团队在无葡萄糖条件下,使用含有11mM肌苷（INO）的培养基培养CAR-T细胞。结果发现,与对照组相比,INO可上调与干性相关的转录本, INO增加了CAR-T细胞的干性特征，增强了CAR-T细胞的功能，并消除了慢性活化CAR-T细胞的免疫抑制，且不依赖于葡萄糖的存在。

肌苷(INO)在体外诱导干细胞并增强CAR - T细胞的功能

然后，研究团队进行了体内实验。在Nalm6-GD2白血病模型中， HA-INO-与HA-CAR-T细胞相比，肿瘤生长延迟，总生存率提高。在针对CD19白血病的应激测试中，INO处理的CD19-CAR-T细胞在体内也表现出更高的抗肿瘤活性。另外，在Her2-CAR骨肉瘤模型中，亦能观察到在接受Her2-INO-CAR治疗17天后，小鼠血液中的循环T细胞比对照Her2-CAR-T细胞多10倍。这些结果表明INO在血液系统和实体瘤中均可增强CAR-T细胞的抗肿瘤能力和持久性。

肌苷（INO）在体内增强CAR-T细胞抗肿瘤功能

接下来，研究团队探索了INO对CAR-T细胞代谢的影响。通过单细胞蛋白组学分析发现,INO可减少CAR-T细胞糖酵解途径相关酶的表达，增加谷氨酰胺酶和多胺代谢酶的表达，提示INO可重新编程CAR-T细胞的代谢。

肌苷（INO）可重新编程精疲力竭的CAR-T细胞的代谢

另外，在表观遗传学方面，INO通过增加多胺代谢诱导表观遗传重编程HA-CAR-T细胞，ATAC-seq结果显示INO诱导广泛的染色质可及性变化，也证明了INO提升了CAR-T细胞的干性。

INO通过增加多胺代谢诱导表观遗传重编程HA-CAR-T细胞

此外，在大规模临床级生产方面，与使用标准葡萄糖基培养基制造的细胞相比，使用INO培养基大大提升了CAR产品的质量，符合临床标准。

临床规模生产GD2-CAR-T细胞使用含有INO的培养基提高了CAR产品的质量

总之，本研究探究了腺苷(Ado)在CAR-T细胞衰竭中的作用，以及通过细胞内途径增强CAR-T细胞疗效的可能性。结果发现,过表达腺苷脱氨酶(ADA)或使用肌苷（INO）可显著改变CAR-T细胞的转录组、表型和功能，增加CAR-T细胞的多胺代谢,改变细胞的代谢重编程和表观遗传状况，显著增强CAR-T细胞的功能和干性。

此外，作者证明了在GMP级制备过程中使用肌苷（INO）培养基扩增CAR-T细胞的可行性。这些CAR-T细胞表现出增强的体内和体外抗肿瘤活性。总体而言,本研究确定了在GMP细胞制造过程中引入INO是一种可行的策略，可以生成更强效的CAR-T细胞。