靶向用药丨胸腔积液如何做基因检测？

癌性胸腔积液 称之为 胸水

随着测序成本以超“摩尔定律”的速度下降，基因检测将越来越普及化，针对大众健康及医院临床方向的的不同商业模式，决定了基因检测针对的人群也将不同，如此情况下对样本类型的要求也将不同。

我们知道市场上基因检测最常见的样本类型有：唾液、口腔拭子、EDTA抗凝血、血浆游离DNA、组织（蜡块/蜡卷/切片/冰冻组织/甲醛固定组织等）、粪便等。

说到靶向用药，样本检测的类型基本上都是血液和组织，但是脑脊液和胸腹水有时也是临床一种常见的基因检测样本类型。

脑脊液：由于血脑屏障阻隔了脑脊液和血液的物质交换，脑部肿瘤病灶的肿瘤细胞和肿瘤DNA较难释放到外周血中，在必要的情况下，也可考虑采用脑脊液进行检测，但获取足够的脑脊液大多数情况下相对比较困难。常见肿瘤为脑癌等。

胸腹水：常见肿瘤并发症，胸腔/腹腔内肿瘤病灶释放的肿瘤细胞和肿瘤DNA会存在于胸水/腹水中，并且有时跟血液相比浓度更高，因此引流的新鲜胸水/腹水也可用来做基因检测。常见肿瘤为肺癌/乳腺癌/胃肠癌/肝癌等。

今天我们着重聊一聊胸水的基因检测，毕竟肺癌是第一高发肿瘤。

胸腔积液常称之为胸水，是一种常见的肿瘤并发症，约50%以上的肺癌患者在疾病过程中将出现胸腔积液。一旦出现，患者的生活质量将会受到明显的影响，容易出现发热、胸闷、呼吸困难等现象。

影像学检测胸水

胸水的来源主要有两种机制：

1，渗出性胸水：恶性胸水，多为一侧，常为血红色，能自凝，沉淀多；是肿瘤直接侵犯胸膜或在胸膜上广泛转移，使胸膜表面毛细血管通透性增加，大量体液渗至胸腔。

2，漏出性胸水：非恶性胸水，多为双侧，常为淡黄色，不自凝，沉淀少；是纵膈淋巴结广泛转移，导致淋巴管回流受阻而引起的，多为漏出液，这种胸水的构成成分也比较正常。

对于胸水，如果肿瘤控制不住，恶性胸水是一直存在的，反而会逐渐加重。恶性胸水里癌细胞的比例往往非常高，而且胸水的癌细胞也与目前进展期病灶的基因突变相近，所以胸水可以作为一种很好的基因检测样本类型。

胸水，里面有肿瘤细胞，有肿瘤游DNA，那么如何做基因检测呢？

首先，我们先说说如何用胸水中的肿瘤细胞进行基因检测，因为肿瘤细胞中的肿瘤DNA含量比较多而且比较完整，所以利用胸水中的肿瘤细胞进行基因检测，对于检测的方法学来说，要求较低，不需要几万X的测序深度及万分之几的灵敏度。胸水沉渣中的肿瘤细胞（tumor cells in pleural effusion，ETCs）已被广泛应用在临床检测中。

胸水样本采集后，需富集肿瘤细胞，第一步需尽快离心，3000rpm离心10min后取沉淀，然后至低温保存，此时可将胸水标本制备成细胞蜡块，这样既可以进行病理质控，也便于长期保存（由于胸水样本的差异较大，有些胸水中肿瘤细胞含量极少，因此建议多采集点胸水进行富集，一般200ml左右即可）。将包埋所得蜡块切片进行HE染色，确定肿瘤类型及肿瘤细胞比例，确定是否适用于基因突变检测，通常≥20%即可。如果没有进行沉淀细胞包埋做HE染色并评估肿瘤细胞的多少，直接针对沉淀的细胞进行基因检测，这样的操作其实不是很合适，因为很多时候，包埋之后做镜检都是阴性的，这时候的阴性报告是不是就坑了患者呢？

其次，如果没有条件进行胸水细胞的富集或者上述包埋的蜡块中没有肿瘤细胞，那么是否可以用胸水上清中的游离肿瘤DNA进行基因检测呢？答案是可以的，但是，对于检测的方法学来说，要求很高，通常需要几万X的测序深度及万分之几的灵敏度，胸水上清液中提取的肿瘤来源DNA（tumor derived DNA from pleural effusion supernatant, etDNA）目前并没有被广泛应用于临床检测中。

一般可以做液体活检的公司，也都是可以做到的，号称几千X测序深度便可达到万分之几灵敏度的液体活检公司就可以放弃了，因为他的基因检测报告终将会以阴性报告而告终。

Tissue-DNA etDNA ETC-DNA ctDNA 研究对比

在2017 WCLC的报告显示：etDNA：肺癌患者胸水上清中的肿瘤来源DNA有望用于基于二代测序（NGS）的基因突变检测。

针对63例肺癌患者（58例腺癌，2例腺鳞癌，2例小细胞肺癌和1例神经内分泌癌）的肿瘤组织（Tissue-DNA）、胸水（etDNA和ETC-DNA）和同期的血浆ctDNA，通过NGS进行基因检测，其中30例患者具有匹配的肿瘤组织标本。每例患者的全血基因组DNA作为胚系基因对照。驱动突变和重排特征通过在肿瘤组织中进行ARMS-PCR、FISH或Ventana IHC作为金标准进行验证。

结果发现在分别检测的etDNA、ETC-DNA和ctDNA标本中，etDNA的肿瘤特有突变检出率比ETC-DNA和ctDNA都高。etDNA中所检出突变的丰度比ETC-DNA和ctDNA均高，而与组织相近。etDNA的基因变异类型和分布与组织接近。CNVs在血浆ctDNA中检出率最低，可能与正常细胞DNA稀释有关。这项研究表明，与ETC-DNA和ctDNA相比，etDNA具有更高的肿瘤特有突变检出率和敏感性。从胸水上清液中获取的etDNA可以作为基因突变检测的优质标本来源，用于指导肺癌患者的治疗决策。