Nat Commun：卡罗琳斯卡医学院团队发表人类植入前胚胎发育的非编码小RNA图谱

瑞典卡罗琳斯卡医学院宣布将2024年诺贝尔生理学/医学奖授予美国科学家Victor Ambros和Gary Ruvkun，以表彰他们在发现微小RNA（microRNA，即miRNA）及其转录后基因调控作用方面的开创性工作。该新闻一经发布，非编码小RNA（sncRNA）再度引起广泛关注。

sncRNA通常短于200个核苷酸，主要类别包括miRNA、转移RNA（tRNA）、piwi相互作用RNA（piRNA）、小干扰RNA（siRNA）、核糖体RNA（rRNA）和小核仁RNA（snoRNA）。已知这些sncRNAs中的每一种都通过调节细胞周期、干细胞维持和分化在生殖和发育中发挥重要作用。此次获得诺贝尔奖的miRNA由于在物种和细胞环境中功能的相对保守性而被深入表征，但它们在人类胚胎发生过程中的精确sncRNA表达动力学和功能仍有待鉴定。

在2024年诺贝尔生理学/医学奖公布前，卡罗琳斯卡医学院在Nature Communications上发表了一篇关于sncRNA在胚胎发育中功能的研究文章，绘制了人类植入前发育中的sncRNA图谱。研究团队在胚胎第3~7天阶段鉴定了sncRNA的表达丰度和进化动力学，确定了特异性sncRNA的作用基因组，揭示了涉及21个isomiRs和tRNA片段（tRF）的发育转变过程，以及两种新miRNA。

这是第一个关于所有sncRNAs在胚胎植入前发育中的广泛报道，提供了关于它们在人类胚囊形成中的动力学和潜在调节作用的见解。

主要研究内容及结果

人类植入前胚胎的单细胞sncRNA比例与表达模式

基于人类植入前胚胎的单细胞sncRNA分析（图1a），研究人员确定了该过程中sncRNAs的主要类别与比例，包括miRNAs（9.62%），snoRNAs（23.8%），rRNA（18.6%），piRNAs（17.2%）和tRNAs（29.3%）（图1c）。其中piRNA和tRNA随着发育而减少，表明该部分sncRNAs大多来自亲本遗传；miRNA、snoRNA随发育逐渐增加，表明其为新生的，与发育相关（图1c）。

进一步的表达模式分析发现，pri-miRNA加工通路因子（DGCR8、DROSHA）总体增加，而piRNA相互作用蛋白和成熟因子（PIWIL2、PIWIL3、HENMT1） 随着发育而相对减少（图 1e）。Argonaute蛋白AGO1-4是RNA诱导的沉默复合物（RISC）的形成基础，可能随发育时间和谱系变化而波动，但表达一直相当丰富，表明miRNA与囊胚形成存在相关功能作用。

图1.人类胚胎中sncRNA的单细胞分析

与胚胎谱系发育相关的miRNA鉴定

研究人员利用单细胞mRNA-sncRNA共测序结合单细胞RNA测序数据对细胞类型进行了准确分类（图2a-c），并为每一个谱系匹配了特异性miRNA（图2d）。结合胚胎发育时间，研究确定了胚胎第3~7天的miRNA表达动力学：miRNA表达第一阶段对应8细胞、桑葚胚和囊胚；随后过渡到以内细胞团（ICM）和滋养外胚层（TE）为主的表达第二阶段（图2f, g）。胚胎第5天出现谱系特异性miRNA，并持续至第7天。谱系前细胞富集到miR-506家族和多能性相关miRNA的表达；发育至ICM阶段时，细胞富集到与小鼠ESC和ICM基态多能性相关的miRNA。

研究人员进一步标记miRNA后，观察到在TE鉴定的基因中约有60%属于嵌入C19MC的 miR-515基因家族（图2i）；源自14号染色体上miRNA簇的miR-154家族在ICM谱系中高度表达，并占富集miRNA的20%。

图2.胚胎发育过程中的谱系鉴定和miRNA 动力学分析

研究鉴定了与谱系发育相关的两个基因组热点：TE细胞中位于Chr.19q13（C19MC）区域的123kb片段的上调；ICM细胞中位于Chr.14q32（C14MC，图3a, b）区域的180kb片段的上调。有趣的是，C14MC簇在谱系前细胞中即可检测到，随后仅在ICM中富集，调控基态多能性并发挥类似滋养层细胞的作用，这表明在胚胎发育过程中，C14MC簇的功能可能发生了转变。

研究人员重点关注了miR-381-3p的功能，在小鼠胚胎模型（8细胞期和32细胞期）中使用不同剂量的miR-381-3p模拟物进行培养，观察到高剂量的模拟物阻止了胚胎发育向囊，表明miR-381-3p正在修改两个谱系中胚胎细胞的整体基因特征，使其难以区分。综合蛋白质组学分析，miR-381-3p可能在维持ICM样表型和/或阻止TE程序中发挥重要作用。

图3.C19MC和C14MC在早期胚胎中的富集和表达

接下来，研究人员鉴定了其他sncRNA的细胞类型特异性特征，成功捕捉到snoRNA表达的不同细胞类型特征（图3c）。SNORD112-114和ICM富集的miRNA的基因组共定位表明，C14MC可能在ICM谱系出现的同时产生snoRNA和miRNA前体。这是C14MC在ICM中表达的首次报道，表明该基因位点在维持多能性和ICM谱系形成中可能发挥重要作用。

植入前胚胎中miRNA的运动轨迹和拟时序分析

研究人员通过拟时序分析评估miRNA差异表达（DE）模式，观察到两个分支ICM和TE，（图4b）。在前谱系中富集到的miRNA包括miR-184、miR-204-5p、miR-508-3p和 miR-513a-5p，它们可能来自母系遗传（miR-184与miR-204-5p和miR-508-3p已被证明一起存在于人类卵子中）（图4c）。

ICM的发育与miR-182和miR-376家族（miR-376a-3p和miR-376c-3p）密切相关。沿着滋养层轨迹，miR-27b-3p显示异常上升，其可能通过抑制多能性标志物参与滋养层分化（图4e）。同样，miR-519c-3p和miR-1323是C19MC的关键成员，在滋养层细胞系中高度表达。

图4.早期胚胎发育中miRNA表达的拟时序分析

新型miRNAs的鉴定

研究人员鉴定了6种新型miRNA，其中2种利用miRDeep2严格鉴定了其丰度、序列和基因位点特征。这些新型miRNA与来自小鼠和秀丽隐杆线虫的miRNA共享一个种子序列，表明它们在进化上是保守的。

随后，研究人员确定了novel_miRNA_4_chr4_29031的潜在基因靶标，其显著下调的靶标包括KMT2A和SMARCD2。因此研究人员推测 novel_miRNA_4_chr4_29031有助于从受精卵到囊胚的表观遗传重编程。

图5.ICM谱系富集miRNA（左）与TE谱系富集miRNA（右）的靶基因网络

结 语

该研究阐明了早期人类发展的一个以前未被探索的方面，重点解析了与人类植入前胚胎向两个谱系（ICM和TE）阶段发育相关的miRNA的表达模式与进化动力学，验证了重点miRNA——miR-381-3p在维持小鼠胚胎ICM阶段的潜在功能，鉴定了两个重要的miRNA基因组热点——C19MC和C14MC，并推断了miRNAs的靶标以及两种新型miRNA的结构与表达模式。研究表明了sncRNAs，尤其是miRNAs在胚胎发育研究中的潜在前景，并为后者深入探索miRNA的其他功能作用提供了参考依据与图谱。

总之，该研究的全面分析增强了人们对早期胚胎发生的理解，并为再生医学和生殖健康中的靶向治疗干预开辟了道路。此外，该图谱可用于帮助将基于干细胞的胚胎模型和原始人类胚胎干细胞系与其体内对应物进行对比。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-52943-w