JHLT：验证miRNA作为心脏异体移植排斥的非侵入性生物标志物的临床效用

循环微RNA（miR）已被确定为心脏同种异体移植排斥的潜在有价值的非侵入性生物标志物，可能有助于临床医生最大限度地减少协议心肌活检（EMB）的数量。然而，大多数文献都基于有偏见风险的回顾性横断面研究。因此，在独立队列中前瞻性验证miR排斥特征至关重要。2023年7月23日发表在JOURNAL OF HEART AND LUNG TRANSPLANTATION的多中心病例对照研究中，我们之前确定了排斥的miR特征，在排斥和正常心脏异体移植之间具有不同的组织和血清表达。对循环miR的评估允许在有异体移植排斥的患者和没有异体移植排斥的患者之间进行特别高的辨别。我们设计了一项纵向前瞻性多中心观察研究，旨在验证这种心脏排斥反应的循环miR特征（通过循环微RNA非侵入性检测心脏异体移植排斥）。

在获得我们当地机构审查委员会批准的协议的书面同意后，患者从全国各地的11个移植中心招募了患者。我们的研究符合ISHLT道德声明。主要目标是前瞻性验证之前确定的3种循环MIR与伴随EMB排斥反应的组织病理学诊断之间的联系。根据国际指南，排斥反应被定义为急性细胞排斥反应（ACR）≥2R和/或抗体介导排斥反应（AMR）≥pAMR1。8名患者从2016年8月至2018年3月被包括在内，并在1年内随访。纳入标准是移植后<10年接受EMB的成年心脏移植接受者。排除标准是多器官移植。样本规模是根据对排斥和无排斥之间循环MIR33%的差异表达的估计计算的，显著性水平为0.05，功率为0.90，并考虑到排斥率为7%（n =820）。

在EMB之前收集了血清样本（i）用于所有原因活检；（ii）在去新移植接受者的移植后1个月、3、6和12个月；以及（iii）在1年后移植接受者的年度访问期间。在血清中测量了10a、miR 92a和155miR。如前所述，通过使用cel-miR-39将miR副本号归一化来获得∆Ct值，对感兴趣的miR进行相对量化。然后通过减去每个∆Ct值的∆Ct平均值来获得∆∆Ct。最后，我们确定了每个样品（2（−∆∆Ct））的折叠值。使用miR模拟标准稀释曲线对miR副本数进行绝对量化分析。

我们遵循了观测队列研究报告的STROBE声明清单。使用随机拦截的3级混合效应逻辑回归（随机效应：“主体级”嵌套在“中心级”，固定效应：患者性别、整合方法=自适应高斯-赫米特杂色度，整合点数量=7）测试了循环miR表达和排斥反应之间的关联性，以解释中心内患者的聚类和同一受试者活检聚类。通过计算曲线下的面积和95%置信区间（CI）绘制了接收器操作特性。我们在所有分析中使用了STATA/MP，并认为低于0.05的p值是显著的。

研究结果显示，共有461名患者，代表831名EMB，主要是协议活检（n = 773，93.0%）。心脏移植和EMB之间的中位时间为8个月（四分位范围：3-16个月）。共诊断出79例排斥发作，包括25 ACR ≥ 2 R和56 AMR ≥ pAMR1。在基于204名患者的258个EMB子集，包括49次排斥发作（ACR ≥ 2R = 17，pAMR1(H+) = 14, pAMR1(I+) = 9, pAMR2 = 11）的每协议临时分析中，没有发现任何循环miR与排斥反应的相对表达之间存在联系（miR 10a：OR = 1.05，95%CI = 0.87-1.27，p = 0.61；miR 92a：OR = 0.98，95%CI = 0.87-1.10，p = 0.68；miR 155：OR = 0.91，95%CI = 0.76-1.10，p = 0.33）。

图1：循环微RNA表达的接收器操作特征曲线，以检测伴随的活检证明的排斥反应

使用对163名患者的191 EMB子集循环MIR的绝对量化的敏感性分析，包括74次排斥发作（ACR ≥ 2R = 23，pAMR1(H+) = 25，pAMR1(I+) = 12，pAMR2 = 16），证实了循环miR和排斥反应之间缺乏联系（miR 10a：OR = 1.05，95%CI = 0.98-1.11，p = 0.18；p = ; miR 92a：OR = 1.00，95%CI = 0.999-1.001，p = 0.60，miR 155：OR = 1.00，95%CI = 0.999-1.002，p = 0.07）。在主要和灵敏度分析中，检测排斥和无排斥之间循环MIR33%差异表达的后验功率计算分别为0.75和0.77。以不同的方式定义同种异体移植排斥或分别考虑ACR和AMR对我们的结果没有任何影响。然后，对剩余血清的分析因徒劳而停止。

综上所述，在这个大型未选定患者的前瞻性队列中，之前确定的心脏排斥反应的循环MiR特征没有得到验证。首先，缺乏前瞻性验证可能反映了回顾性病例对照研究固有的重要偏见（样本量有限、选择偏见）。其次，限制miR临床应用的一个重要问题是跨研究（miR-144-3p，miR-181a-5p，miR-142-3p和miR-101-3p，miR-29c-3p，miR-486-5p4）以及外部验证miR排斥特征时歧视下降。

在已发表的最大前瞻性研究中与排斥相关的39miR中，只有1被发现与排斥有关。第三，使用内源性miR表达的正常化步骤可能会诱发测量偏差，因为文献中对最佳正常化miR没有共识。然而，即使对miR的绝对量化也未能找到任何相关的关联。最后，我们的分析仅限于3个循环miR。对大量miR的分析可能确定了外部验证过程所需的更强、更稳定的关联，就像最近在没有事先选择任何感兴趣的miR的情况下进行的大型前瞻性研究一样。

原始出处

Coutance G, Racapé M, Baudry G, Lécuyer L, Roubille F, Blanchart K, Epailly E, Vermes E, Pattier S, Boignard A, Gay A, Bruneval P, Jouven X, Duong Van Huyen JP, Loupy A. Validation of the clinical utility of microRNA as noninvasive biomarkers of cardiac allograft rejection: A prospective longitudinal multicenter study. J Heart Lung Transplant. 2023 Nov;42(11):1505-1509. doi: 10.1016/j.healun.2023.07.010. Epub 2023 Jul 23.