天津医科大学ACS Nano: 仿生糖肽水凝胶治疗牙周炎

不可逆的牙槽骨吸收是牙周炎的重要临床表现之一，它由菌斑生物膜引发，并因破骨细胞活动和成骨作用的失衡而加剧，影响患者的咀嚼功能，并导致牙周炎的高复发率。在此，为了在牙周炎中重建骨稳态，天津医科大学邓嘉胤&中国医学科学院生物医学工程研究所王伟伟/Feng Zujian制备了一种载有米诺环素盐酸盐（MH）的糖肽水凝胶（MH/GRWgel），通过连续的抗菌和阻断RANKL活性来调节牙槽骨吸收。GRWgel显示出类似细胞外基质（ECM）的纤维状和多孔微观结构，可作为细胞增殖和分化的支架，并具有包括可注射性、自愈特性和良好的生物相容性等优点。在原位注射后，MH在早期阶段迅速从水凝胶中释放，展现出强大的抗菌效果，以对抗深牙周袋中的生物膜。此外，MH/GRWgel与RANKL具有高特异性结合效率，通过屏蔽RANKL/RANK相互作用和增强成骨分化来抑制破骨细胞成熟，从而协同调节骨稳态。在大鼠牙周炎模型中，MH/GRWgel通过抗菌活性、抑制牙槽骨吸收和促进骨再生显著减缓牙周炎的进展，其效果优于商业凝胶治疗。这些发现表明，MH/GRWgel在调节骨稳态方面具有优势，为牙周炎提供了一种有前景的治疗策略。该研究题为“Bioinspired Glycopeptide Hydrogel Reestablishing Bone Homeostasis through Mediating Osteoclasts and Osteogenesis in Periodontitis Treatment”发表在《ACS Nano》。

方案1展示了一种生物启发的米诺环素盐酸盐(MH)载药糖肽水凝胶(MH/GRWgel)的设计和作用机制，该水凝胶具有持续的抗菌活性，并且能够恢复牙周炎中的骨稳态。它通过顺序发挥抗菌和阻断RANKL(核因子κB受体激活因子配体)的作用来调节牙槽骨吸收，首先通过局部释放MH来对抗深牙周袋中的生物膜，然后通过特异性结合RANKL来抑制破骨细胞成熟，并增强成骨分化，从而协同调节骨稳态。这种策略不仅抑制了细菌生长，还通过调节骨吸收和形成之间的平衡来支持牙槽骨再生，最终在大鼠牙周炎模型中显示出比商业凝胶更优越的治疗效果。

方案1. 生物启发型MH/GRWgel的示意图，该材料具有持久的抗菌活性，能够恢复牙周炎中的骨稳态

【GRWgel的制备及其物理化学性质】

图1展示了GRWgel的制备过程及其物理化学特性。通过透射电子显微镜(TEM)和扫描电子显微镜(SEM)图像，观察到GRWgel具有类似细胞外基质(ECM)的纳米纤维状和多孔结构，圆二色谱(CD)谱图证实了RADA肽段形成了特征性的β-折叠结构，且W9肽的加入并未改变这一结构。流变学测试表明，GRWgel显示出固态水凝胶的特性，并且具有可调节的力学性能。此外，GRWgel还表现出良好的自愈合能力和可注射性，这些特性使其在注射后能够迅速恢复凝胶状态。最后，GRWgel在体外环境中的降解实验显示，该水凝胶能够在7天内被持续降解，这些结果表明GRWgel是一种具有良好细胞相容性、可调节力学性能、自愈合能力和可降解性的有前景的药物递送和组织工程支架。

图1. GRWgel的制备及其物理化学性质

【GRWgel显示出良好的细胞相容性并增强了BMSCs的迁移能力】

图2展示了GRWgel良好的细胞相容性以及对骨髓间充质干细胞(BMSCs)迁移能力的增强效果。通过活/死细胞染色，观察到与GRWgel共培养的L929、HGEC和BMSCs细胞大多数存活，仅有少数死亡细胞。CCK-8实验结果表明，这些细胞在与GRWgel共培养后，其增殖能力得到了提升，显示出较对照组更高的细胞活性。此外，BMSCs的迁移实验结果表明，GRWgel能够显著增强BMSCs的迁移能力，这可能归因于GRWgel中的糖肽聚合物为细胞附着、交流和迁移提供了适宜的微环境。这些结果证实了GRWgel作为一种生物材料，对细胞的生长和迁移具有积极的影响，适合作为组织工程和再生医学中的支架材料。

图2. GRWgel显示出良好的细胞相容性并增强了BMSCs的迁移能力

【GRWgel通过与RANKL特异性结合体外抑制破骨细胞的形成】

图3展示了GRWgel通过特异性结合RANKL抑制体外破骨细胞形成的能力的评估。实验中，通过TRAP染色观察到GRWgel处理组的成熟破骨细胞数量显著减少，表明W9肽段能有效抑制RANKL诱导的破骨细胞成熟。此外，Western blot和qPCR实验结果进一步证实了GRWgel能够通过下调c-Fos、NFATc1以及破骨细胞特异性基因MMP9、CTSK和TRAP的表达来抑制破骨细胞的成熟和功能。分子对接和等温滴定量热分析(ITC)实验验证了W9与RANKL之间的高亲和力结合。这些结果综合表明，GRWgel通过其组分W9肽段特异性结合RANKL，阻断RANKL/RANK相互作用，从而抑制破骨细胞的生成，为牙周炎治疗中抑制牙槽骨吸收提供了一种有效的策略。

图3.GRWgel通过与RANKL特异性结合体外抑制破骨细胞的形成

【GRWgel支持高效的细胞粘附并增强体外成骨】

图4展示了GRWgel对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的支持作用及其对细胞粘附和增殖的促进效果。通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察到BMSCs在GRWgel上展现出良好的细胞形态和显著的肌动蛋白束，表明GRWgel有利于细胞粘附。碱性磷酸酶(ALP)染色和阿尔辛红(ARS)染色结果显示，GRWgel处理组的BMSCs表现出更高的矿化结节形成能力，说明GRWgel能够促进BMSCs的成骨分化。此外，通过qPCR和Western blot分析发现，GRWgel能够显著上调成骨相关基因和蛋白的表达，包括ALP、RUNX2、BMP2和COL-I，进一步证实了GRWgel对BMSCs成骨分化的促进作用。

图4. GRWgel支持高效的细胞粘附并增强体外成骨

【MH/GRWgel显示出强大的抗菌活性和去除生物膜的能力】

图5展示了MH/GRWgel的抗菌活性及其消除生物膜的能力。实验中，MH/GRWgel通过局部释放米诺环素盐酸盐(MH)以及RADA肽段的抗菌作用，有效地抑制了牙周炎相关细菌的增殖，包括链球菌、核糖核酸杆菌和牙龈卟啉单胞菌。通过活/死染色和扫描电子显微镜(SEM)观察，MH/GRWgel处理的牙龈卟啉单胞菌显示出较低的存活率和细胞壁损伤。此外，MH/GRWgel还显示出对生物膜的长期抗菌效果，能够显著增加处理后的细菌死亡数量。这些结果表明，MH/GRWgel通过结合MH的抗菌作用和RADA肽段的原位抗菌效果，有效地消除了牙周炎中的细菌感染，包括生物膜中的细菌。

图5. MH/GRWgel显示出强大的抗菌活性和去除生物膜的能力

【MH/GRWgel在体内显示出抗菌活性和抑制牙槽骨吸收】

图6展示了MH/GRWgel在大鼠牙周炎模型中的体内抗菌效果及其对抑制牙槽骨吸收的显著作用。通过在牙周炎诱导的大鼠模型中进行为期一周的治疗后，MH/GRWgel显示出与商业凝胶相当的抗菌效率。进一步的微计算机断层扫描(micro-CT)分析显示，经过四周的治疗，MH/GRWgel显著减少了牙槽骨吸收，增加了骨体积分数(BV/TV)和骨小梁厚度(Tb.Th)，同时降低了骨小梁间隙(Tb.Sp)，表明MH/GRWgel在促进牙槽骨再生方面具有显著效果。

图6. MH/GRWgel在体内显示出抗菌活性和抑制牙槽骨吸收

【MH/GRWgel在体内抑制牙槽骨吸收并促进牙槽骨再生】

图7展示了MH/GRWgel在大鼠牙周炎模型中促进牙槽骨再生的体内效果。通过苏木精-伊红(H&E)染色和Masson三色染色观察到，与对照组相比，MH/GRWgel处理组的牙槽骨高度显著增加，形成了类似正常上皮的上皮组织，并且牙周组织中RUNX2阳性细胞的数量明显增多，表明MH/GRWgel显著促进了成骨细胞的增殖和分化。同时，TRAP免疫组化染色结果显示，MH/GRWgel处理组的破骨细胞数量显著减少，且通过qPCR分析发现，MH/GRWgel能够显著提高成骨相关基因的表达，降低破骨细胞基因的表达。

图7. MH/GRWgel在体内抑制牙槽骨吸收并促进牙槽骨再生

【小结】

该研究制备一种生物启发的糖肽水凝胶MH/GRWgel，该材料结合了抗菌活性、抑制牙槽骨吸收和促进牙槽骨再生的多重功能，能够有效预防病变进展、抑制牙槽骨吸收，并促进牙槽骨再生，在大鼠牙周炎模型中显示出比商业凝胶更优越的治疗效果，强调了通过调节破骨细胞生成和成骨作用来重建骨稳态对于牙周炎治疗的重要性，并指出这种MH/GRWgel在调节骨稳态方面的优势，为牙周炎的临床治疗提供了一种有前景的治疗策略。

原文链接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.4c05677