Nature：边切边补，告别DNA双链完全断裂！新“魔剪”剑指89%遗传变异！
2019-10-25 不详 转化医学网
基因治疗是最具革命性的医疗技术之一，它是以改变人遗传物质为基础的生物医学治疗手段。其中以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑日新月异的发展极大地推动了基因功能研究进程。但是，“基因魔剪”的应用之路并非一帆风顺，技术本身存在的局限性极大地限制了其发展。
导 读：基因治疗是最具革命性的医疗技术之一，它是以改变人遗传物质为基础的生物医学治疗手段。其中以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑日新月异的发展极大地推动了基因功能研究进程。但是，“基因魔剪”的应用之路并非一帆风顺，技术本身存在的局限性极大地限制了其发展。
近日，单碱基编辑技术开创者、Broad研究所David Liu教授研究团队在顶级学术期刊Nature发表了最新的基因编辑研究成果，报道了一种被称为“prime editing”的新型基因编辑技术。该研究革新了CRISPR/Cas9技术，成功在避免DNA双链断裂的基础上增加了可执行基因组编辑的类型，减少了基因插入失控和脱靶效应，提高了精准修正率，有望修正约89%的疾病相关人类遗传变异体！
CRISPR/Cas9——“基因魔剪”“魔力”受限
CRISPR/Cas9技术是一种RNA引导的基因组编辑技术，理论上能对基因进行精确敲除、敲入、替换等，从而探究基因功能、修复致病基因，为构建更高效的基因编辑技术提供了可能。但是，大量实验结果却指出CRISPR/Cas9对大多数突变的精准修正效率不高，插入缺失副产物导致的基因紊乱引发了群众对CRISPR/Cas9的犹豫。那么，“基因魔剪”“魔力”为何受限呢？
我们知道，CRISPR/Cas9进入细胞后，CRISPR序列可转录出 pre-crRNA和tracrRNA，而pre-crRNA、tracrRNA以及Cas9编码的蛋白将会组装成一个复合体。gRNA可通过碱基互补配对靶向目标序列，识别出与crRNA互补的前间隔序列，DNA双链将被解开。crRNA将与互补链杂交，而另一条链则保持游离状态。随后Cas9蛋白剪切crRNA互补的DNA链和非互补的DNA链，最终形成双链断裂（DSB），而生物体自身存在的DNA损伤修复应答机制可将断裂的上下游两端的序列连接起来，从而实现了细胞中目标基因的敲除。
换言之，CRISPR/Cas9编辑的核心步骤是双链DNA的断裂，这种断裂的主要修复方式是非同源末端连接，这是一种错误率极高的修复方式，容易发生移码插入或缺失，进而引发基因功能丧失，这就严重限制了CRISPR/Cas9的精准修正率，所以，想要打破这种局限性，就要避免双链DNA的断裂。
prime editing——边切边补，告别双链断裂
既然不想DNA双链一起断裂，那就只能分开修正，也就是说要对突变的位置进行“定点”修正。如何实现呢？研究人员将Cas9蛋白与逆转录酶，以及一种特殊的gRNA——pegRNA合成一个复合体。pegRNA不仅可以搜索特定的DNA位点，还能在Cas9-逆转录酶融合蛋白切割一条DNA链后直接用预编辑的遗传信息替换靶DNA序列，随后另一种可精确修复的DNA修复方式——同源修复启动，将新的遗传信息接入DNA序列。而另一条DNA链只要将这些步骤再实施一次就可正确编辑。这就实现了“边切边补”，彻底杜绝了DNA双链同时断裂引发的错配危机。
研究人员指出，prime editing技术能进行12种单碱基的转化，其最多可以插入44个碱基或删除80个碱基。他们在人体细胞执行了超过175次的编辑，确定这项技术比传统CRISPR/Cas9基因修正的精确率更高，效果更好，而且减少了副产物，更降低了脱靶率！
这项研究指出了一种新颖的基因编辑方案，克服了传统CRISPR/Cas9的盲点，这就意味着prime editing技术有望成为未来基因编辑领域更为绚烂的明星。当然这需要更多的时间和实验对其效果加以证明，我们静候佳音！
原始出处：
Andrew V. Anzalone, Peyton B. Randolph, Jessie R. Davis, et.al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature 21 October 2019
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