干细胞治疗糖尿病临床研究进展

作者：南京大学医学院附属鼓楼医院 朱大龙 陈丽，山东大学齐鲁医院 李莉蓉

　　研究背景

　　据国际糖尿病联合会（the International Diabetes Federation,IDF）报道，目前全球糖尿病发病率为7%，也即，全球已有近2.5亿糖尿病患者。而伴随人口老龄化、生活方式的改变以及肥胖发生率的增加，2025年全球糖尿病患者人数将升至3.8亿。其中，亚洲与南美地区糖尿病发病率的增加尤为突出^[1]。

　　目前，无论是1型糖尿病（T1DM）患者还是病程晚期的2型糖尿病（T2DM）患者，都必须借助每天注射胰岛素及血糖监测来维持机体正常的血糖水平，以减少心、肾、视网膜等糖尿病并发症的发生。而在胰岛素治疗领域中，尽管已经有了胰岛素类似物、胰岛素皮下泵以及新的胰岛素给药途径等多方面突破，已接受胰岛素注射却未实现良好血糖控制的患者仍然占有很高的比例。

　　同时，美国糖尿病控制与并发症试验（Diabetes Control and Complication Trial，DCCT）显示，最大限度地逆转T1DM患者的胰岛功能，对延缓其并发症的发生具有重要作用。

　　基于这一现状，各国学者们开始致力于一种新的治疗策略——向患者机体补充新的具有正常分泌功能的胰岛β细胞。目前，实现这一目标的可能方法包括：胰腺或胰岛移植、促进内源性胰岛细胞再生、减少胰岛细胞凋亡、诱导特殊类型的干细胞向胰岛细胞分化等^[2.3]。

　　1990年，圣路易华盛顿大学医疗中心的内科医生在世界上首次采用异体胰岛移植成功治疗了一例T1DM患者^[4]。其后，全球范围内相继出现了多种不同方案的胰岛移植，包括最为著名的“埃德蒙顿方案”。在这一方案中，人们首先从多个供体的胰腺组织中分离出足够数量的胰岛，然后，将分离出的胰岛通过门静脉输注入患者体内。基于这种治疗，患者体内的血糖水平能维持正常达数年^[5]。这表明，胰岛移植很可能是治愈T1DM的新途径。但是供体来源的极其缺乏以及免疫抑制剂的终身服用，均限制了该方案在临床上的推广应用。更为重要的是，移植后患者体内功能性胰岛细胞很可能受到胰岛自身免疫反应的再次“攻击”，伴以促炎性细胞因子的出现、胰岛β细胞凋亡率的增加等，这些因素造成移植后患者五年内的病情缓解率远不如人意（小于10%）^[6]。

　　成体胰岛组织移植治疗糖尿病所具有的局限性，促使人们将研究重点转向了糖尿病的细胞治疗领域。可作为胰岛β细胞替代治疗的理想干细胞，需具备两方面的特性：一方面，它能够合成、储存、释放胰岛素，并且具有与机体自身胰岛细胞相似的刺激-反应偶联机制，以应对不同环境因素的刺激（如：营养物摄取、激素与神经递质的释放等）;另一方面，干细胞的增殖特性必须受到机体的调控，以免移植后出现干细胞向胰岛β细胞的过多分化，产生胰岛素瘤性低血糖。有效识别出同时具有上述功能与分化调控特性的干细胞类型，至今仍是国内外学者面临的一项艰巨任务。

　　目前，已确定的可分化为胰岛β细胞的干细胞类型主要包括：胚胎干细胞、成体干细胞（来源于胰腺、骨髓、肝、肠上皮、神经上皮等）、诱导性多能干细胞等。其中，骨髓干细胞移植治疗糖尿病具有良好的临床应用前景。

　　骨髓干细胞是血细胞与淋巴细胞的共同起源。主要包括两种类型：①造血干细胞（Hematopoietic stem cells，HSC）：可分化为血细胞，并可分化为各种非造血组织的细胞；②间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSC）：具有较强的免疫抑制活性，且同样具有多分化潜能。现已证实，这两种类型的干细胞在糖尿病细胞治疗领域均具有其应用前景。

　　HSC移植治疗T1DM

　　自体骨髓造血干细胞移植（Autologous hematopoietic stem cell transplantation，AHST）治疗T1DM

　　AHST方案的具体步骤如下^[7]:

• 采用小剂量环磷酰胺与粒细胞集落刺激因子将患者骨髓造血干细胞动员至外周血循环中；
• “采集”骨髓造血干细胞，采用白细胞分离法纯化后予以超低温冷藏保存；
• 对拟接受移植的患者进行大剂量化疗（环磷酰胺200 mg/kg，兔抗胸腺细胞球蛋白4.5 mg/kg），以清除其体内的淋巴细胞（包括自身反应性与非自身反应性）；
• 将体外纯化后的造血干细胞重新回输入患者体内。

　　现已证实，这些输注后的造血干细胞会迁徙至骨髓中进一步分化为成熟免疫细胞，促使患者体内实现“免疫重建”。

　　2003年，Voltarelli等^[8.9]研究组率先在临床中采用AHST方案治疗了23例T1DM患者[入选标准：发病年龄为12~35岁；病程小于6周；无酮症酸中毒史；谷氨酸脱羧酶抗体（GAD-Ab）检测阳性]。在平均29.8个月（7~58个月）的随访期间，有12例患者停止使用外源性胰岛素（平均为31个月），其中最长停用时间达52个月；另外8例患者停用胰岛素不同时期后重新进行胰岛素治疗，但注射剂量较移植前明显减少（0.1-0.3 IU/kg）；完全停用胰岛素治疗的12患者平均糖化血红蛋白（HbA_1c）<7.0%，在移植后24个月和36个月时，混合餐C肽释放曲线下平均面积（AUCC）由移植前（225.0±75.2）ng/ml分别显著增至 (785.4±90.3)ng/ml、(728.1±144.4)ng/ml；而重新注射胰岛素的8例患者，移植后36个月和48个月时AUCC同样较移植前有所增加，此外，在这8例患者中，2例患者在接受西格列汀（二肽基肽酶Ⅳ抑制剂）治疗后，重新停用胰岛素。

　　随访期间的不良反应如下：2例患者发生双侧院内获得性肺炎，3例患者出现其他内分泌腺体功能低下，9例患者发生少精液症。所有患者均未发生意外死亡。

　　世界其他中心的研究结果

　　2006年，中国南京大学医学院附属鼓楼医院朱大龙等在造血干细胞移植治疗T1DM的临床应用方面进行了有益探索^[10.11]，与Voltarelli等研究方案比较，其主要不同点在于：

　　①研究对象的入选标准不同：未规定发病年龄的低值界限（发病年龄≤35岁）、延长了病程筛选的界定值（病程≤1年）、均以酮症酸中毒起病、胰岛自身抗体的阳性种类具有异质性；

　　②改良了造血干细胞的回输途径：对于病程≥2月的患者，采用经脾动脉或胰动脉插管回输法，以增加患者体内局部胰腺组织的干细胞浓度，提高干细胞向胰岛细胞分化的几率，进而提高其临床有效性。

　　2006年6月-2008年7月，该研究组共筛选了15例T1DM患者，移植后的疗效显示：①3例患者于移植后不同时期内停用胰岛素,其中，1 例患者因停药期间未控制饮食，于停用19.2个月后重新注射胰岛素，但注射总量较术前减少50％（17u/日），余2例患者停用胰岛素至今（停用时间分别为48个月、36个月）；②6例患者移植后胰岛素用量均较移植前不同程度减少（分别为20 u/d、14 u/d、7 u/d、5 u/d、4 u/d、3 u/d）；③15例患者于移植后12个月、24个月、36个月平均C肽水平较移植前均有不同程度增加，而同期平均HbA_1c较移植前有不同程度降低；④不良反应：1例患者于移植后6个月出现原发性甲状腺功能减低症。所有患者均未发生出血性膀胱炎、重度感染及死亡等严重不良反应。

　　2008年，上海瑞金医院宁光等同样采用造血干细胞移植治疗了18例无酮症酸中毒史的T1DM患者[6例男性，12 例女性；平均年龄为（18.8±4.4）岁]，结果显示（资料尚未发表）：44.4%(8/18)患者完全脱离胰岛素治疗，其余患者胰岛素用量的减量幅度平均为（67.3±22.4）%；18例患者的平均C肽水平在术后明显上升，C肽曲线下面积（AUCC）上升更为显著，且可维持1年。所有患者均出现不同程度的胃肠道反应，脱发，发热，骨髓抑制等不良反应，于干细胞回输后的2~4周逐步消失。

　　后续研究

　　2008年8月，在美国芝加哥，Voltarelli等起草了一项国际多中心、随机对照AHST临床研究方案，以进一步证实AHST的“免疫重建”效应。这项研究经过FDA和美国研究伦理机构（research ethics organizations）的批准，已于2009年正式启动^[12]。

　　安全性问题

　　目前认为，HSC移植治疗糖尿病，主要的潜在风险在于：

　　⑴重症感染: 由于大剂量的化疗预处理, 患者白细胞数可降至0, 尽管在无菌层流仓中, 仍可能并发感染, 而且感染可能贯穿HSC移植的始终。因此，需要在HSC前后预防性或治疗性予以抗生素。

　　⑵出血:在骨髓受抑期, 患者血小板极低, 可能并发颅内、消化道及其它组织器官（如膀胱）的出血等。通过输注血小板可以减少这种风险性。

　　⑶移植物抗宿主病( graft versus host diease, GVHD)：该病分为急性及慢性两类, 是导致移植失败及患者死亡的主要原因之一。采用AHST方案治疗糖尿病患者，可以避免GVHD的发生。

　　⑷其他内分泌腺体的功能减低：Voltarelli等^[8.9]与朱大龙等^[10.11]发现，AHST治疗后的少数T1DM患者可发生其他内分泌腺体功能的减退。但是，这是否反映了多发性内分泌腺功能减退练合征(polyendocrine autoimmune syndrome，又称polyglandular Butoimmune syndrome，PGA)Ⅱ型的病情进展，还是与HSC移植过程中的大剂量化疗有关，难以确定。

　　MSC移植治疗T1DM

　　MSC移植治疗糖尿病已受到世界范围内糖尿病学者的广泛关注。2008年，Ribeirao Preto – USP医学院研究组成员率先采用异体MSC移植治疗T1DM患者^[12]。该方案的具体步骤如下：①麻醉状况下对患者的一级亲属进行骨髓活检以获取MSC；②将MSC进行体外扩增（约1月）；③将约100 ml的MSC胶状液回输至患者体内。

　　与AHST方案比较，异体MSC移植的主要不同点在于：患者无需接受大剂量化疗；间隔一月后，患者会接受MSC的重复输注（回输量尚未确定）。目前，已有2例患者接受了异体MSC移植，现处于随访观察期。

　　2009年，南京大学医学院附属鼓楼医院朱大龙等采用异体BM-MSC/ UCB-MSC移植探索性治疗了15例T1DM患者，随访至今（资料尚未发表），1例患者间断停用胰岛素（为期1月），2例患者胰岛素用量较移植前不同程度减少（分别为8 u、13 u）；15例患者在移植后3个月、6个月、12个月时的平均HbA_1c水平较移植前均不同程度降低。所有患者均未出现严重感染、死亡等严重不良反应。由于患者的平均随访期较短，该方案的远期疗效性及安全性仍待进一步确定。

　　值得注意的是，近期有研究报道^[13]：从自身免疫性疾病患者自身获取的自体MSC，同样具有正常的形态学表型及分子信号传导通路，并表现出良好的免疫抑制效应。而山东大学齐鲁医院陈丽教授等筛选了31例胰岛功能较差的T2DM，通过骨髓活检获取其自身的骨髓细胞（包括 MSC与HSC），并在麻醉条件下通过动脉插管直接回输至患者胰腺，结果显示（资料尚未发表）：移植后患者的胰岛功能得到显著改善，平均胰岛素用量显著减少。这初步表明，采用自体MSC移植治疗糖尿病患者（包括T1DM和T2DM），同样具有良好的可行性与疗效性。

　　相关组织的指南

　　关于干细胞移植应用于临床治疗人类疾病所涉及的伦理性问题，干细胞领域中的“引领性”组织已发布了若干指南性声明与建议。这些组织包括：美国国立卫生研究院（National Institutes of Health，NIH http://stemcells.nih.gov/）、国际干细胞研究协会（International Society Stem Cell Research，ISSCR www.isscr.org）、国际细胞治疗研究协会（the International Society for Cell Therapy，ISCT www.celltherapysociety.org）等。这些声明既有助于患者更清楚的了解糖尿病细胞治疗领域中所涉及到的道德伦理性问题，也有利于公众与媒体正确认识干细胞移植潜在的应用前景，避免悲观排斥与期望值过高两种极端态度的发生。

　　未来的研究方向

　　大量的基础研究工作，为干细胞移植应用于糖尿病的临床治疗提供了强有力的依据。但是，关于干细胞移植治疗糖尿病的临床有效性及安全性等方面，各国学者仍然存在争议。

　　总结目前临床应用研究中所存在的相关问题及经验教训，各国学者在开展后续临床研究时，应该避免重要的方案参数之间存在明显差异。这些参数包括：研究对象的入选标准、研究的终点指标、干细胞的分离与培养方法、干细胞移植数量与频率、干细胞移植时间及途径等。

　　同时，鉴于糖尿病的发病机理与干细胞生物学特性均具有复杂性，我们需要组建一支包括糖尿病、干细胞、免疫学等多领域专家学者在内的综合性研究队伍，以进一步优化干细胞治疗糖尿病的临床方案，降低其潜在的风险性。只有同时做好这两方面的工作，后续的临床研究才能提供强有力的循证医学依据。

　　需要强调的是，只有通过国际多中心、大样本量的临床研究和深入的机理探讨，我们才能真正驾驭好“干细胞移植”这一新的治疗马车，将人类糖尿病的防治推向一个完全崭新的天地！

　　结语

　　在干细胞移植治疗糖尿病的临床研究历程中，我们取得了一些令人鼓舞的成果，但更重要的是，我们积累了宝贵的经验与教训。我们应该有信心，通过纠正一些错误的方向，循着更合理、科学的途径进行更深入的摸索一定能将干细胞移植治疗推向一个新的高度，假以时日，采用干细胞移植“治愈”糖尿病患者，也许不再是一个远不可及的梦！　　

　　主要参考文献

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