RNA和DNA测序助力儿童淋巴瘤精准诊疗，结合案例分析

本研究旨在评估将最先进的测序技术和流式细胞术整合到儿童淋巴瘤诊断中的可行性。在儿童淋巴瘤常规诊断活检中纳入了RNA测序（RNAseq）、全外显子组测序（WES）和流式细胞术。1年中，对110例疑似恶性淋巴瘤儿童患者的122个活检样本进行了分析。报告了结合组织学和免疫组化、流式细胞术和NGS的标准化流程的经验。83%（102/122）的新鲜组织样本进行了流式细胞术分析，快速诊断 T 细胞和 B 细胞非霍奇金淋巴瘤。所有非霍奇金淋巴瘤活检样本和 42%（19/45）的霍奇金淋巴瘤样本进行了 RNAseq。除了一个易位未检测到，RNAseq检测到荧光原位杂交（FISH）和 PCR 发现的所有其他易位。RNAseq和WES识别了常规方法未检测到的其他遗传学异常。最后，重点介绍了3个案例，说明了如何实现不同诊断技术和专家之间的协同作用。本研究表明了现代测序技术和流式细胞术整合到淋巴瘤常规诊断中的可行性，并讨论了附加价值。在儿童淋巴瘤患者中，RNA和DNA测序的纳入不仅能支持诊断，而且能为开发基于研究的新型治疗策略奠定基础。

研究背景

目前，淋巴瘤诊断依赖于组织学和免疫组化，荧光原位杂交（FISH）检测遗传易位和PCR检测克隆性作为补充。这些技术耗费人力和时间，并不一定能导致准确的诊断，尤其是对于需要分子变异进行诊断的疾病，如伴有11q异常的高级别B细胞淋巴瘤。重要的是，儿童淋巴瘤患者的临床表现通常为急性，需要快速诊断，以及时开始治疗。

在过去十年中，DNA 和 RNA 下一代测序（NGS）技术迅速发展，变得更快，更具成本效益，且技术要求更低，改变了分子诊断的格局。在儿童癌症中，基于RNA测序（RNAseq）的融合基因检测显示出比传统方法更高的灵敏度，使诊断率提高了约40%。2018 年，RNAseq 和全外显子组测序（WES）导致鉴定出至少 5 个成人弥漫性大 B 细胞淋巴瘤（DLBCL）亚群。与传统的免疫组化和细胞遗传学分类相比，这些遗传特征不仅为DLBCL发病机制提供了新的信息，而且改善了预后预测，并具有治疗意义。儿童淋巴瘤是罕见疾病。尽管在过去几年中，大多数儿童淋巴瘤类型的治疗结局变好，但儿童肿瘤学家越来越多地面临新的困境：例如，在 B 细胞非霍奇金淋巴瘤（NHL）中，化疗的急性治疗相关毒性要求特定患者群体降阶治疗。尽管最近发表的研究提出了可能将其识别的生物标志物，但数据相互矛盾，并且缺乏结合大型测序数据集和临床结局信息的前瞻性分析。因此，目前很难为儿童 B-NHL 患者设计基于研究的降阶策略。在许多诊断和治疗儿童癌症患者的癌症中心，活检处理问题通常是阻碍在常规诊断中实施RNAseq和WES的原因。

免疫球蛋白（IG）或 T 细胞受体（TR）基因的克隆性是恶性淋巴瘤的标志，传统上通过 EuroClonality/BIOMED-2 多重 PCR 方法结合片段长度分析进行评估。最近的靶向 NGS 方法，可以深入了解单个克隆型序列的组成，有望更准确地评估克隆性，通过确立克隆关系，为了解和监测疾病提供更多机会。

尽管多色流式细胞术是血液系统恶性肿瘤（如白血病）诊断和分类的成熟技术，适用于淋巴瘤样本单细胞悬液，但在许多中心，并未作为淋巴瘤诊断的标准技术。其能够在数小时内识别 NHL，区分成熟和淋巴母细胞 T-NHL 和 B-NHL。在危重症儿童淋巴瘤患者中，这可能有助于做出诊断以快速开始治疗。这对于高危成熟 B-NHL 儿童患者尤为重要，这些患者经常出现医疗急症，无论组织学亚型如何，都接受相同的化疗方案治疗。

本研究报告了我中心将流式细胞术、IG/TR 靶向 NGS、RNAseq 和 WES 整合到儿童淋巴瘤常规诊断中的经验。在全国范围内，所有疑似淋巴瘤患儿都被转诊到我中心。血液病理学诊断包括形态学、流式细胞术、病理学和分子诊断。

本研究呈现了 2020 年 6 月 15 日至 2021 年 6 月 15 日这 1 年间转诊的 110 例疑似恶性淋巴瘤患者的数据。9 例患者接受了 ≥1 次重复活检，共分析了 122 个组织活检样本。通过 3 个病例强调了该诊断方法的益处，并讨论了未来的意义。提出了一种诊断流程，其他医院也可将WES和RNAseq纳入常规淋巴瘤诊断中。本研究表明了将现代测序技术整合到儿童淋巴瘤常规诊断中的可行性，并讨论了机会。

研究结果

患者特征

1年中，本国家儿童癌症中心分析了110例21岁以下患者的122个组织样本。所有患者均因疑似恶性淋巴瘤而转诊至我中心。活检时的中位年龄为14.4岁（范围为0.6-20.6岁）（表1）。42例患者为女性（38%）。75%（82/110）的患者诊断为恶性淋巴瘤，其中 1 例患者为霍奇金淋巴瘤（HL）合并原发性纵隔 B 细胞淋巴瘤（PMBL）。大多数患者（51%，42/82）诊断为经典型HL和淋巴细胞为主型HL（13%，11/82），其次是成熟B-NHL（22%，17/82）。25%（28/110）的患者诊断为非恶性疾病，包括17例（非特异性）反应性淋巴结炎，5例肉芽肿性炎症，3例生发中心进行性转化，2例感染或自身免疫性疾病，1例Kikuchi淋巴结炎（又称组织细胞坏死性淋巴结炎）。9 例患者因不同原因接受了 >1 次活检：2 例患者因非诊断性或非恶性材料接受重复活检，1 例患者为了获取额外组织用于分子检测，3 例患者因怀疑疾病复发或进展，2例患者接受 ≥1 次额外活检以证明淋巴瘤位于不同解剖部位。1例患者在另一家医院接受了重复活检，原因没有说明，很可能是因为第一次活检的组织量太少。在淋巴瘤患者中，15%（12/82）表现为临床急症，其中纵隔肿块压迫气道是最常见的原因，这部分患者中83%（10/12）在活检前开始类固醇治疗。在所有淋巴瘤患者中，6%（5/82）基于流式细胞术诊断开始治疗。

表1

流式细胞术

大多数组织样本（83%，101/122）和大多数患者（86%，95/110）可以进行流式细胞术分析。流式细胞术在 22% 的分析组织（22/101）中检测到异常克隆性 B 细胞或 T 细胞群，直接诊断为 T-NHL 或 B-NHL，其中 23%（5/22）的患者快速开始治疗。重要的是，这22个组织样本占进行流式细胞术分析的NHL患者的绝大多数（88%的样本[22/25]和83%的患者[19/23]）。在另外 1 例活检样本不可及的患者中，使用胸腔积液进行流式细胞术分析，诊断为复发性伯基特淋巴瘤。值得注意的是，在高危成熟 B-NHL儿童患者中，所有组织学亚型的治疗都是相同的，因此流式细胞术诊断足以在具有临床指征时直接开始治疗。流式细胞术分析能够将 T-NHL 与 B-NHL 区分开来，并可以辅助区分 HL 和 NHL。正如预期的那样，在 38 例患者的 HL 组织中，均未检测到淋巴瘤细胞，而在 NHL 中均检测到。所有患者都进行了免疫组化来明确组织学诊断。快速流式细胞术指导了要进行的免疫组化染色的合理选择，这对于只有少量活检材料的患者特别有价值。

组织学和免疫组化

如果活检材料量足够，制作新鲜冷冻组织切片，由儿童血液病理学家进行评估。20个活检（16%）在另一家医院进行，没有冷冻组织或寄送组织。在其他 102 个活检中，96 个（94%）收集了新鲜冷冻材料。2例患者的冷冻材料被加工成FFPE，1例进行了微生物分析。

在 3%（3/102）的活检中，材料量不足以用于新鲜冷冻切片。所有新鲜冷冻切片评估了肿瘤细胞百分比，并对最具代表性的新鲜冷冻组织进行分子检测。根据形态学和鉴别诊断对FFPE组织进行免疫组化染色。流式细胞术结果有助于选择合适的抗体进行免疫组化。除1个活检样本外，所有其他活检样本均确立了组织学诊断（121/122）。这 1 个活检样本由于组织坏死和机械损伤没有明确结论。患者接受了额外的活检，提供了明确的诊断。在 121 个活检样本中，11 个（9.1%）分子检测结果有助于诊断，包括DLBCL vs 双打击淋巴瘤鉴别诊断3例，DLBCL vs PMBL鉴别诊断2例，DLBCL vs 伯基特淋巴瘤鉴别诊断1例，DLBCL vs 伴有IRF4重排的大B细胞淋巴瘤鉴别诊断1例，伴有11q异常的高级别B细胞淋巴瘤1例，低级别滤泡性淋巴瘤1例，排除组织细胞增生症1例，通过克隆性检测排除淋巴瘤1例。在明显的伯基特淋巴瘤或间变性大细胞淋巴瘤中，分子检测为组织学诊断提供了额外的支持（9.1%，11/121活检）。

FISH和RNAseq检测淋巴瘤特异性易位

17%（22/122）的淋巴瘤组织切片进行了 ≥1 种遗传易位FISH 检测，cMYC、BCL2、BCL6、ALK、IRF4、DUSP22 和 MALT1 FISH 检测共 63 个。其中，17%（11/63）为阳性，3%（2/63）不确定（表2）。在唯一一例RNAseq未检测到IGH::MYC易位的病例中，表达分析显示MYC高表达，提示潜在的IGH::MYC易位。FISH检测到的所有其他相关易位RNAseq也检测到（91%，10/11）。此外，在一些患者中，RNAseq发现了新的或罕见的易位：DLBCL中的TBL1XR1::TP63，T-LBL中的HOXA9::TRBC2，B-LBL中的SSBP2::CSF1R和肝脾T细胞淋巴瘤中的IGH::FLNA。

表2

WES和RNAseq识别新的分子变异

WES 和 RNAseq 可以发现新的分子变异。6/28 个非恶性淋巴结进行了 RNAseq，未显示任何变异。所有 NHL 活检样本和 42%（19/45）的 HL 样本进行了 RNAseq。在该队列中，48%（15/31）的 NHL 病例进行了 WES。与其他儿童恶性肿瘤相比，在NHL中检测到的突变数量相对较高。在分析的NHL样本中，检测到多种未报道过的分子变异，其临床意义目前尚不清楚。然而，收集这些变异将能够与临床结局数据相关联，识别用于治疗分层和预后预测的新标志物。例如，最近研究显示，具有 NOTCH1 和/或 FBXW7 突变的 T-LBL 为低风险组。因此，在当前的EIC NHL LBL-2018研究中，携带 NOTCH1 和/或 FBXW7 突变的淋巴瘤患者被分层到标准风险治疗组，接受强度较低的化疗，而没有 FBXW7 或 NOTCH1 突变的患者被随机分配接受高风险治疗方案。将现代测序技术整合到标准诊断检查中有助于发现新的生物标志物，提供更多的淋巴瘤生物学信息。对所有样品的处理是相同的，因此具有无偏倚和统一的优点。

病理学不确定时，结合流式细胞术、RNAseq和WES

以下 3 个案例说明了当组织学和免疫组化结论不明确时，流式细胞术、RNAseq 和 WES 有助于诊断。

病 例 1

一名 13 岁男孩出现膈肌上下广泛淋巴结肿大、多发性溶骨性病变以及肝脏和脾脏受累（图 1）。进行了皮下颅骨活检、淋巴结活检、骨髓活检和 L5 椎体骨活检。颅骨病变、骨病变和骨髓样本流式细胞术检测到 CD45dim、CD19+、CD20+、CD10− 和 CD22+ 表型的细胞群，表面 kappa 轻链表达微弱。淋巴结活检样本流式细胞术未发现任何异常群体。骨/颅骨病变样本组织学和免疫组化显示成熟 B-NHL，鉴于异质性 CD30 染色模式和阳性 CD23 染色，符合 PMBL。淋巴结活检样本诊断为经典型HL。IG/TR基因靶向NGS显示，HL和NHL组织存在相同的克隆性Vκ-Jκ重排，重排特异性实时荧光定量PCR进一步证实。诊断为复合经典型HL和PMBL（生物学相关）。克隆相关性检测影响了治疗选择，决定根据 EIC NHL Inter-B-NHL-Ritux 2010方案对患者进行治疗。存在 2 种独立的恶性肿瘤的情况下，应考虑整合 HL 治疗的要素（例如，对诱导治疗或应用检查点抑制剂后未实现完全代谢缓解的病变进行放疗）。此外，对于同时出现 2 种独立的淋巴瘤的患者，需要咨询临床遗传学家，评估是否存在遗传学异常，如 DNA 修复缺陷综合征。后一种诊断可能会影响治疗和诊断方法的选择。

图1

病 例 2

一名 15 岁的李-佛美尼综合征患者出现复发性骨肉瘤，对腹部肿块进行活检，该肿块位于右上和下腹部，起源于结肠（图 2）。活检样本流式细胞术显示成熟克隆性 B 细胞群表达 CD45、CD19、CD20 和 CD10，并具有表面 kappa 轻链限制。组织学显示中等大小的细胞，具有伯基特样形态，呈弥漫性生长模式，存在细胞凋亡。表现出细胞学多形性。免疫组化显示 B 细胞标记物 BCL6 和 CD10 染色呈阳性。Ki67增殖指数>95%。FISH 未检测到 BCL2、BCL6 和 cMYC 易位。RNAseq未显示典型的IGH::MYC易位。WES 显示 2 个致病性 TP53 突变，其中一个是已知的李-佛美尼综合征胚系突变，还检出致病性 KMT2C 移码突变。拷贝数分析显示，与其他儿童肿瘤相比，基因组不稳定，具有许多拷贝数变异（CNV），包括染色体11q扩增和缺失，与先前报道的伴有 11q 异常的高级别 B 细胞淋巴瘤的 11q 异常高度相似。此外，还检测到染色体 1p、2q、12p、18q、19 和 20p 异常。这些发现与 Salaverria 等人在 11q 病变中观察到的一致：平均 12 个 CNV。此外，Salaverria 等人发现，在伴有 11q 异常的 B-NHL 中，除了 11q ，未检测到其他强烈重现性遗传学异常。病例之间的相关分子变异差异很大。淋巴瘤被归类为高级别 B-NHL（伴有 11q 异常的高级别 B 细胞淋巴瘤）。正如对伴有 11q 异常的高级别淋巴瘤所预期的那样，临床反应良好。淋巴瘤治疗诱导完全缓解。

图2

病 例 3

一名 15 岁患者出现肾脏肿块和纵隔淋巴结肿大（图 3）。对肾脏肿块进行活检。流式细胞术显示成熟克隆性 B 细胞群具有 CD45+、CD19+、CD20+、CD10−、CD30+ 表型和表面 lambda 轻链限制。组织学检查显示中等大小的淋巴样细胞，胞质苍白，背景有脆弱纤维化。免疫组化显示 B 细胞标记物CD30、PD-L1（SP263）和 CD23 染色呈阳性。Ki67增殖指数为30%-40%。FISH 未检测到 BCL2、BCL6 和 cMYC 易位。鉴别诊断包括DLBCL和PMBL。分析了WES和RNAseq数据，显示常见于PMBL的分子变异，如SOCS1和PTPN1体细胞突变。此外，还发现多个CNV，包括PMBL中报道过的染色体2p和9扩增。综合这些结果，诊断为PMBL。我们在其他淋巴瘤（如伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤和 DLBCL）的磁共振成像（MRI）和正电子发射断层扫描-计算机断层扫描（PET-CT）中也观察到肾脏病变。WES 和 RNAseq 数据支持 PMBL 的诊断。在过去的 5 年中，我中心有 1 例三打击 B-NHL 患者和 2 例伯基特淋巴瘤患者通过病理学诊断肾脏病变。因此，WES和RNAseq对于支持诊断和更好地了解这些罕见疾病非常重要。

图3

整合流式细胞术、WES、RNAseq和免疫组化的可行性

将流式细胞术作为免疫组化、WES 和 RNAseq 之前的第一个诊断性检查，可使所有 T-NHL 和 B-NHL 患者在 3 个工作日后开始治疗（如有需要）。此外，RNAseq和WES分析提供重要的分子变异信息，有助于做出准确的诊断。基于这一经验，提出了一种流程，如图 4 所示。这缩短了诊断时间，能够在有临床指征时快速开始治疗。流式细胞术结果可以指导选择哪些免疫组化标志物进行分析。这在活检材料很少的病例中尤为重要。

图4

讨 论

本研究表明，将传统组织学和免疫组化与流式细胞术、WES 和 RNAseq 相结合用于儿童淋巴瘤的常规诊断是可行的，或能提高诊断的准确性和有效性。本文提出的流程可以在必要时进行快速诊断和临床决策，并生成测序数据，为制定适应风险、研究驱动的治疗策略奠定基础。

流式细胞术由于其快速性，是一种理想的初始筛查工具，可以快速诊断 B-NHL 和 T-NHL，从而在必要时迅速做出临床决策。由于流式细胞术和免疫组化评估的标志物存在重叠，流式细胞术结果可以指导免疫组化抗体的合理选择。此外，标记物的重叠使这些独立技术的结果能够相互关联，有助于解读结果，为观察到的免疫表型提供可靠的重新确认。此外，在组织中观察到的流式细胞术免疫表型可以作为检测骨髓和脑脊液中（微小）淋巴瘤播散的参考——如果不知道确切的诊断免疫表型，这可能很困难。剩余的细胞悬液可以合并到生物库中，促进转化研究，这是重要的额外价值。

现代测序技术，如 RNAseq 和 WES ，在提出的流程中发挥着不同的关键作用，可以提供详细的分子信息，在鉴别诊断中具有确认性或决定性作用。当传统的免疫组化无法确定时，RNAseq支持诊断，WES提供额外的信息，来做出诊断。重要的是，RNAseq和WES不仅可以识别已知的易位和分子变异，还可以发现可能与临床结果相关的新分子变异。这可能会导致用于治疗风险分层和结果预测的生物标志物的发现。基于RNAseq和WES数据的特定疾病分类在未来或许能够定义儿童患者风险组，就像在成人DLBCL患者中一样。更多中心实施提出的工作流程不仅可以支持诊断过程，还有助于深入了解淋巴瘤生物学，并为研究创建有价值的数据集。我们认为，在组织诊断方面，研究和诊治之间的划分不符合儿童淋巴瘤患者的利益。儿童淋巴瘤是罕见的疾病，因此，有义务从每个样本中获取尽可能多的数据。如果不这样做会产生后果。将诊断性RNAseq和WES数据与临床信息相关联有助于预后预测和治疗分层。如果这些数据是在不同的中心，在诊断程序的严格质量要求下以无偏倚的方式产生的，那么它们可以为设计新的治疗方案奠定坚实的基础，根据分子检测结果对化疗强度进行分层。对于回顾性研究中发现的分子变异，不了解其预后相关性，是因为在大型真实世界、无偏倚且具有详细临床信息的患者队列中缺少其存在的信息。例如，B-NHL患者的治疗结果总体上较好。然而，化疗的急性治疗毒性较高，需要在选定的患者群体中进行降阶治疗。尽管最近有关于识别这些患者群体的潜在生物标志物的研究发表，但数据相互矛盾，并且缺乏将大型测序数据集与临床结果信息相关联的前瞻性分析。因此，目前很难为B-NHL患者设计基于研究的降阶策略。对于进行性或复发性伯基特淋巴瘤的儿童患者，预后仍然较差。同样，在本研究中，患者队列在高质量诊断标准下以无偏倚的方式生成的相关 RNAseq 和 WES 数据集未与临床信息相关联，阻碍了这些患者生物标志物和新疗法的开发。现在执行诊断程序为未来改进治疗奠定基础。如果对有临床注释的WES和RNAseq数据集的分析发现了相关靶标，靶向测序将充分发挥其潜力。

在某些情况下，通过IG/TR基因靶向DNA测序进行克隆性评估可以提供额外的关键信息，例如，关于不同病变之间的克隆关系（如病例1）或区分新淋巴瘤和疾病复发。相同的克隆型信息也可以用于开发用于播散性疾病定量的分子检测，这在我中心正越来越多地实施。在较小的医院和资源较少的国家，本研究提出的工作流程可能较难实施，但即使纳入其中一些技术，如常规对淋巴结活检样本进行流式细胞术分析，也已经可以改善诊断。

重要的是，我们不仅鼓励大型学术中心选择提出的流程，还希望与较小的中心合作确立组织处理方案，以便可以通过先进的技术分析淋巴瘤组织，即使活检是非集中进行的。在我中心，几乎所有病例都进行RNAseq而不是FISH，现在RNAseq也可使用FFPE材料。这使得RNAseq与新鲜冷冻材料的可及性无关。

最近发布了改进的成人淋巴瘤实验室检查指南。尽管这些推荐是针对成人人群的，但也可能适用于儿童人群。肿瘤委员会召开多学科会议根据具体情况讨论患者，对于应用图 4 的流程很重要。我们认为，通过集中诊断和治疗，临床医生和诊断专家之间的敏捷工作流程和快速信息交换是改善儿童淋巴瘤诊断的绝对优势。RNAseq和WES分析或可生成算法提高诊断准确性。这可以提高患者获得正确诊断的机会，可能支持普通病理学家做出儿童淋巴瘤诊断，无论有无专门的血液病理学家。

获取足够的肿瘤材料仍然很重要。在我中心，常规进行淋巴结切除活检用于诊断儿童淋巴瘤。穿刺活检可能无法产生足够的组织来进行组织学、免疫组化、流式细胞术、WES 和 RNAseq，因此可能导致诊断准确性、有效性、精确度和可靠性降低。

总之，将现代测序技术纳入诊断，不仅可以降低诊断不确定性，提高诊断效率，还可以在高诊断标准下生成无偏倚、真实世界儿童淋巴瘤患者队列RNAseq和WES数据集，促进治疗的改善。这最终可以打破由于缺乏对其相关性的了解而无法对分子发现采取行动的瓶颈。

参考文献：

Scheijde-Vermeulen MA, Kester LA, Westera L, Tops BBJ, Meyer-Wentrup FAG. Integration of RNA Sequencing, Whole Exome Sequencing, and Flow Cytometry Into Routine Diagnostic Workup of Pediatric Lymphomas. Lab Invest. 2023 Oct 26;104(1):100267. doi: 10.1016/j.labinv.2023.100267. Epub ahead of print. PMID: 37898291.