广州中医药大学新进展：黄连干姜汤如何利用蛋白质组学修复肠道屏障，缓解溃疡性结肠炎

溃疡性结肠炎（UC）是一种慢性且特发性的炎症性肠病，临床表现主要为腹痛、腹泻以及血便等症状。其发病机制相当复杂，涉及多种因素，包括年龄、遗传差异、生活压力、饮食习惯以及肠道微生物群的失衡等。随着生活模式和心理压力的急剧变化，UC在发达国家和发展中国家的发病率均呈上升趋势，给家庭和社会带来了巨大的经济和医疗负担。因此，寻找更为安全有效的治疗方法显得尤为迫切。目前，中药因其显著的疗效和较低的毒性，已经引起了研究人员的广泛关注，其中一些中药已被证实对UC具有良好的治疗效果。

黄连干姜汤（HGD）最早见诸于《备急千金要方》，其配方由黄连、干姜、人参、甘草等中药材构成。该方具有收敛止泻、清热除湿、温胃健脾、化湿止呕以及调和诸药的功效。古籍文献指出，HGD对于腹痛、腹泻以及粘液脓血便等症状具有疗效。在先前的研究中，已经确立了HGD在治疗UC中的应用方法。

近日，一篇名为“Huanglian Ganjiang decoction alleviates ulcerative colitis by restoring gut barrier via APOC1-JNK/P38 MAPK signal pathway based on proteomic analysis”的文章探究了HGD对结肠炎的治疗作用。

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HGD减轻了DSS引起的小鼠结肠炎 

研究利用DSS成功造就UC小鼠模型（图2A），经HGD治疗七天后，UC小鼠体重下降、腹泻、便血、结肠长度缩短、脾脏肿大及胸腺萎缩等症状有所缓解，尤其是中剂量（HGD-M）和高剂量（HGD-H）组的治疗效果与美沙拉嗪相当。HGD-M、HGD-H以及美沙拉嗪均显著减轻了体重下降、降低了疾病活动指数（DAI）评分、延长了结肠长度、减少了脾脏指数（P<0.01，P=0.001）并增加了胸腺指数（P<0.0001）（图2B–F）。ELISA检测结果显示，与对照组相比，模型组小鼠的IL-6和IL-1β水平显著升高（图2I–J），与IL-6和IL-1β的mRNA水平变化相似（图2G–H）。HGD-M和HGD-H显著降低了IL-6（P<0.05）和IL-1β（P<0.05）的mRNA水平以及IL-6（P<0.01，P<0.05）和IL-2β（P<0.01）的蛋白水平。

图2 HGD缓解DSS诱导的小鼠结肠炎

HGD改善了结肠组织结构，修复了结肠黏膜组织

HE染色结果显示，模型组的结肠上皮细胞及肠腺排列呈现紊乱状态，隐窝形态亦发生显著变化。大量炎症细胞浸润于结肠黏膜及其下层组织，同时结肠肌层出现水肿现象。HGD治疗后，上述病理变化有所缓解，尤其在HGD-M、HGD-H组以及美沙拉嗪组中，缓解效果更为显著（图3A–B）。此外，HGD还显示出剂量依赖性地改善结肠组织病理变化的效应。AB-PAS和PAS染色分析表明，与对照组相比，模型组结肠杯状细胞数量及糖蛋白含量均有所下降，而HGD治疗组与美沙拉嗪组则显示出恢复正常水平的趋势（图3C–F）。

图3 HGD改善结肠组织结构，修复结肠黏膜组织

HGD恢复结肠炎小鼠的紧密连接蛋白和肠道屏障的完整性

紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1的信使RNA在模型组中表现出下调现象，而在中剂量和高剂量的HGD处理组中则观察到上调趋势（图4E–G）。免疫荧光技术结果显示，与对照组相比，模型组中紧密连接蛋白Occludin和Claudin-1的表达显著减少，而HGD-M、HGD-H处理组则显著提升了Occludin和Claudin-1的表达（图4A–D）。蛋白质印迹分析结果亦呈现出相似的模式（图4H–J）。这些结果共同表明，HGD能够保持紧密连接结构，降低肠道的通透性，从而增强肠道屏障的功能。

图4 HGD恢复了结肠炎小鼠的紧密连接蛋白和肠道屏障的完整性

HGD治疗结肠炎的网络药理学分析

该研究通过TCMSP数据库筛选出155个受UPLC/MS-MS鉴定化合物影响的潜在靶点，并在Genecards数据库获取了4800个UC相关疾病靶点。Venn图分析显示了101个HGD与UC共有的靶点（图5A），Cytoscape软件构建了HGD成分、HGD靶点与UC靶点之间的相互作用网络（图5B）。GO分析揭示了HGD通过影响若干生物学过程、细胞组分及分子功能对UC发挥治疗作用（图5D）。其中，排名前三的生物学过程包括脂多糖介导的信号传导、miRNA转录的正向调控以及上皮细胞凋亡过程的调控，这暗示肠上皮屏障的改变可能是HGD影响UC的关键机制。KEGG分析显示，该机制可能与丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路及紧密连接相关（图5C），基于共同分子靶点的数量及P值分析。先前研究指出，p38 MAPK信号通路能够下调紧密连接蛋白Occludin和Claudin-1的表达。因此，研究从屏障修复和MAPK信号通路的角度探讨了HGD抗结肠炎活性的潜在机制。

图5 HGD治疗结肠炎的网络药理学分析

APOC1是HGD对结肠炎小鼠的潜在调控靶点

蛋白质组学分析显示（DEPs），这些蛋白质在模型组中表达上调，而在HGD处理组中则下调，反之亦然。基于TMT的蛋白质组学分析揭示，290个DEPs在模型组中显著升高，而在HGD处理后显著降低。另外，26个DEPs在模型组中显著降低，而在HGD处理组中则明显逆转（图6A）。生物信息学富集分析显示，这些DEP主要富集于葡聚糖代谢过程、能量储备代谢过程等多种生物过程中，以及IL-17信号通路、中性粒细胞胞外陷阱形成和糖酵解/糖异生等多种信号通路中（图6B-C）。特别地，APOC1在模型组中显著上调，而在HGD组中显著下调（图6D–E）。据文献报道，APOC1与MAPK信号通路及肠道炎症反应密切相关。因此，APOC1被确定为HGD改善结肠炎小鼠的潜在靶点。

图6 APOC1是HGD调控结肠炎小鼠的潜在靶点

HGD通过抑制APOC1-JNK/ P38MAPK信号通路恢复肠道屏障

结合网络药理学与蛋白质组学的研究成果，可以推断HGD通过调节APOC1-JNK/P38MAPK信号通路，进而改善肠道屏障功能并减轻结肠炎症状。为此，研究采用蛋白质印迹技术检测了APOC1及其相关下游分子在MAPK信号通路中的表达水平。结果显示，与对照组相比，模型组中p-p38-MAPK、p-JNK以及APOC1的表达显著上升，而Occludin和Claudin-1的表达则有所下降。经过HGD治疗后，P-P38-MAPK、P-JNK和APOC1的表达水平显著降低，同时Occludin和Claudin-1的表达水平则有所回升（图7A–F）。这些数据表明，HGD能够抑制APOC1及下游MAPK信号通路的活性，从而增强紧密连接蛋白的表达，恢复肠道屏障功能。由此可见，HGD可能通过抑制APOC1-JNK/P38MAPK信号通路来促进肠道屏障的修复。

图7 HGD通过抑制的APOC1/P38MAPK信号通路恢复肠道屏障

结论

综上所述，HGD能够缓解由DSS引发的结肠炎相关症状，并在中等剂量和高剂量水平下恢复肠道屏障的稳定性，且其潜在的作用机制可能涉及对APOC1-JNK/P38MAPK信号通路的抑制。

参考文献：

He YX, Li YY, Wu YQ, Ren LZ, Wang Y, Wang YM, Yu Y. Huanglian Ganjiang decoction alleviates ulcerative colitis by restoring gut barrier via APOC1-JNK/P38 MAPK signal pathway based on proteomic analysis. J Ethnopharmacol. 2024 Jan 10;318(Pt B):116994. doi: 10.1016/j.jep.2023.116994