ADC的迭代史

前言

抗体偶联药物（ADCs）在过去10年中取得了长足的进展，ADC是一种通过一个合理构建的连接子将细胞毒性小分子药物偶联到单克隆抗体上的复合物，可以向肿瘤内选择性地输送有效的细胞毒性药物。

2009年gemtuzumab ozogamicin（Mylotarg) 是美国食品和药物管理局（FDA）批准的第一个ADC药物。目前，FDA已经批准上市了16个ADC药物，还有上百个ADC药物正处于临床研究阶段。   2009年，卡利霉素、金盏花素和美登素类药物是用于ADC开发的主要细胞毒素。十年来，这些分子仍然被用作有效载荷进行优化，以获得更好的稳定性和亲水性。新的细胞毒性物质也被开发出来，如PBDs、杜卡霉素和喜树碱衍生物等。

抗体工程在10年间也已经取得了相当大的进展，允许更多的位点特异性偶联，提高了ADC的均一性和稳定性。新的第二代和第三代ADC已经进入临床，以期获得更好的治疗效果和安全性。几十种基于半胱氨酸残基、非天然氨基酸或分子工程模式的生物偶联技术也已经在临床前研究获得了验证。此外，更多的肿瘤特异性抗原靶点和肿瘤内细胞毒性药物的释放机制使ADC获得了爆炸式的发展，ADC药物进入了黄金时代。

第一代和第二代ADC

一个成功的ADC药物取决于两个关键因素。第一需要一个稳定可靠的连接子连接抗体和有效载荷，这个连接子在血浆循环中保持稳定，并且在肿瘤细胞内吞后迅速切割，以便有选择地将有效载荷传递到肿瘤中，并限制由于非靶向毒性引起的不良反应。连接子需要对溶酶体条件（蛋白酶、酸性和还原介质）敏感。

第二个成功的关键因素是必须将一种强大的细胞毒性剂偶联到抗体上。事实上，由于有效载荷（例如蒽环类药物）的效力较低，第一批ADC的特点是治疗指数较低，导致到达最大耐受剂量（MTD）时治疗效果依然非常有限。

Mylotarg、Besponsa和第一代可切割连接子

Mylotarg于2000年被FDA批准用于治疗急性髓细胞白血病（AML）。它是由卡奇霉素通过一个包含腙键的可切割连接子与gemtuzumab（一种突变的抗CD33 IgG4亚型单抗）偶联而成。这种ADC的平均药物抗体比(DAR)只有1.5，含有约50%的未偶联单克隆抗体。ADC内化后，腙键可在内体酸性环境中水解，释放出卡奇霉素的前体，然后由谷胱甘肽还原为自由活性的卡奇霉素。后者与DNA小凹槽结合并经历Bergman环化，从而产生高度反应性的双自由基，引起序列选择性DNA双链切割。

从理论上讲，腙在生理pH值下应在血液循环中保持稳定，并在酸性条件下内化后进行选择性水解。然而，Mylotarg的连接子表现出一定的不稳定性，导致卡奇霉素在血浆循环中过早释放，严重的毒性导致随后辉瑞公司在2010年将Mylotarg退市。

得益于近年来在临床上积累的经验以及技术的进步，Mylotarg于2017年重新获批，优化后提高了连接子的稳定性，以较低剂量使用，并修改给药计划，适用于不同的患者群体。

一个类似的连接子被开发出来并用于将卡奇霉素偶联到inotuzumab，一种突变的CD22靶向抗体上， inotuzumab-ozogamicin (Besponsa）于2017年被FDA批准用于治疗急性淋巴细胞白血病（ALL）。

Kadcyla和第二代不可切割连接子

鉴于这些发现，人们继续开发连接子设计的替代策略。然而，一个偶然的发现使Immunogen得以识别出一种出人意料的有效ADC。DM1通过含有N-琥珀酰亚胺基-4-（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸盐（SMCC）的不可切割的连接子与曲妥珠单抗的赖氨酸残基偶联，这种ADC（T-DM1，Kadcyla）于2013年经FDA批准用于HER2阳性乳腺癌患者。

这种新型的ADC在HER2阳性乳腺癌模型中非常有效，只有ADC在内化后在溶酶体中经酶完全消化后，原始结构才具有活性，以获得活性代谢物Lys-MCC-DM1。

Adcetris, Polivy和第二代可切割连接子

与此同时，西雅图遗传学设计了自己的偶联技术，通过可切割连接子mc-VC-PABC，其中包含马来酰亚胺基间隔子、作为组织蛋白酶底物的标准Val Cit二肽序列和PABC自降解间隔子，将金盏花素（MMAE）生物偶联到抗CD30 抗体的半胱氨酸残基上，这种ADC（Adcetris）于 2011年被FDA批准用于间变性大细胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤的治疗。

Adcetris在肿瘤细胞内化后，可切割连接子降解，释放出的MMAE能破坏靶细胞并扩散到细胞膜上，到达并杀死邻近的癌细胞。这种现象被称为旁观者效应，允许释放的MMAE杀死CD30阳性和CD30阴性的肿瘤细胞。

类似地，这种第二代连接子（mc-VC-PABC）被用于Polivy，一种将MMAE与polatuzumab（抗CD79b单抗）偶联的ADC，于2019年6月被FDA批准用于治疗成人弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）。

第三代ADC

由于前两代ADC包括单抗的内化、转运或再循环有关的干扰、抗原的脱落以及 ADC 的溶酶体降解缺陷都会导致药物释放的减少，从而影响 ADCs 的疗效。因此，亟需开发与生物偶联、载体形式、连接子或毒性药物相关的新技术，以拓宽 ADC 的应用领域，第三代ADC应运而生。

位点特异性的ADC

尽管ADC取得了越来越大的成功，但直到2019年，市场上每一个批准的ADC都是以异质混合物的形式存在的，单抗上的细胞毒性药物数量不同且分布在不同的地方，导致了生产过程中的分析问题。事实上，DAR是不受控制的，这种复杂的混合物会显著影响ADC的药代动力学和药效。

裸抗体可能是一种竞争性抑制剂，弱DAR偶联物的疗效较差，而具有高DAR的抗体在血浆中会被迅速消除，从而损害了ADC的治疗窗口。为了拓宽ADCs的治疗指数，自2008年以来，区域特异性生物结合方法得到广泛发展。这些位点特异性方法可分为三类：（i）天然或非天然氨基酸的生物偶联，（ii）使用酶的生物偶联或（iii）基于连接物的生物偶联。

第一种方法是通过抗体工程引入特定的氨基酸。Junutula和他在Genentech的同事是先驱者，他们通过在靶向卵巢癌抗原MUC16的单克隆抗体的265位氨基酸与Adcetris®连接子进行定点生物偶联，开发出一种ADC。为此，他们在单克隆抗体的氨基酸序列中引入了两种半胱氨酸，选择了这两种半胱氨酸来保持IgG折叠和与抗原结合。

将得到的TDC（ADC-硫单抗）与使用传统随机生物结合方法生成的ADC进行比较。

两种ADC在小鼠异种移植模型中均有效，但TDC在大鼠和食蟹猴体内的耐受性高于ADC，并且在体内表现出较低的全身毒性。受此策略的启发，Seattle Genetics和Spirogen开发了一种类似的技术，称为MAIA，通过在mAb关键区域的239位引入丝氨酸半胱氨酸突变，实现PBD二聚体的生物偶联。

第二种可能性是使用酶介导的区域特异性生物结合技术。谷氨酰胺转胺酶催化天然单抗的谷氨酰胺侧链与含有伯胺的分子之间形成酰胺键。基于此，Innate Pharma已经开发了一种使用谷氨酰胺转胺酶构建ADC的三步方法，如下图所示。

最后，区域特异性ADC也可以从天然单抗中产生。

在这一策略中，由创新的二溴甲基酰胺（DBM）或二噻吩基马来酰亚胺（DSPh）组成的异质双功能连接体可以通过区域特异性生物偶联产生更均匀和更稳定的ADC，DAR为4。

其它ADC形式

尽管其疗效显著，但大多数针对实体肿瘤的ADC并没有超过2期临床试验的进展，这表明，为了进入市场，还需要优化其他参数。ADC的有效性受到其大小（150 kDa）的限制，与肿瘤的穿透和吸收不良有关。除了IgG的大小，现在人们认为IgG的Fc部分对于ADC的疗效来说是不必要的，甚至是不需要的，事实上，由FcRn诱导的ADC半衰期较长增加了对健康组织的暴露，而FcγR与内皮细胞和免疫系统发生交叉反应，这两种现象与靶外毒性有关。

较小的结合形式已被探索以弥补这些缺点，特别是肽、单域抗体片段（sdAb或VHH）、单链抗体（scFv）、抗原结合片段（Fab）或使用CHε4结构域二聚化的小免疫蛋白（SIP）。作为该策略的一部分，最近，auristatin衍生物与抗HER2单链抗体（源自曲妥珠单抗）的位点特异性偶联产生了两种新的单链抗体药物偶联物（SDCs）。

与天然单链抗体相比，这两种SDC保持了对HER2的亲和力，并且能够在体外有效地杀死SK-BR-3her2阳性细胞（EC50分别为0.68nm和0.32nm），对HER2阴性MCF-7细胞无影响。

尽管DAR为1的SDC不如相应的DAR为4的ADC强大，但这项工作代表了设计具有更高DAR的更有效的小型结合物的第一步，为进一步的体内或甚至临床研究开辟了道路，以评估其对实体瘤的潜力。

目前以HER2为靶点的ADC在清除表达相对较低HER2+癌细胞方面是无效的。因此，只有大约20%的乳腺癌患者有资格接受HER2靶向治疗。此外，HER2表达的肿瘤内异质性最终导致最初对治疗有反应的患者复发。为了在具有更广泛HER2表达范围的癌细胞中获得有效的抗肿瘤活性，MedImmune开发了针对HER2的双翼ADC IMMU4276。 

与Kadcyla®相比，在代表不同亚群患者的各种肿瘤模型中，这种双翼ADC显示出优越的抗肿瘤活性。此外，两个组合突变（L234F和S239C）减少了与FcγR的结合，以减少FcγR介导的正常组织中ADC特异性内化，从而减少了血小板减少等副作用的发生。不幸的是，由于高肝毒性，2018年该ADC也在临床停止。

新靶标和相关释放系统

在富含细胞间质的实体瘤中，在癌细胞表面靶向内化抗原是非常困难的。因此，一种新的方法被开发出来，由肿瘤微环境（基质或血管系统）代替癌细胞。在这种策略中，细胞外蛋白酶和细胞外基质的其他成分（如酸性介质或还原性谷胱甘肽）可用于有效的细胞外释放用于非内化ADC的细胞毒性。

纤维连接蛋白是肿瘤内皮下细胞外基质的一种成分，与癌细胞表面相比，更容易获得免疫结合。SIP形式是单链抗体片段与人IgEεCH4结构域融合的结果。SIP（F8）在C-末端位置用两个未成对的半胱氨酸残基生成，允许两个DM1分子进行区域特异性生物偶联，以产生SIP（F8）-SS-DM1的DAR=2的偶联物。 

在治疗实验中，SIP（F8）-SS-DM1比IgG（F8）-SS-DM1的类似物效果更好。

在F9畸胎瘤小鼠模型中，以5mg/kg 5次注射给药，以相等（等摩尔）剂量在体内比较两种偶联物。SIP偶联物使五分之四的小鼠肿瘤完全缓解，而IgG结合物仅观察到有限的肿瘤缓解。这两种结合物也被证明在细胞毒性DM1释放动力学方面存在显著差异。非内化ADC的优点是避开了免疫结合物内化的某些抵抗机制，而区域特异性生物结合方法控制DAR，避免了DAR为0的成分出现。

新型细胞毒性药物

新的细胞毒药物已经被开发出来，以靶向低抗原表达或对auristatins或maytansinoids耐药的癌细胞。为此，人们开发了PBD二聚体，这些二聚体的分子结构包含两个烷基化亚胺官能团，能够与DNA形成共价键。PBD二聚体比传统细胞毒性药物（MMAE或DM1）的效力高约50-100倍。Spirogen和Seattle Genetics将PBD二聚体作为ADC细胞毒性物质引入，并开发了SGN-CD33A（vadastuximab-Talinine）和SGN-CD70A，然而很不幸，这两种基于PBD的ADC最近在III期临床试验中被迫停止。SGN-CD33A与致命感染和可能的肝毒性导致的较高的患者死亡率相关，而SGN-CD70A与血小板减少有关。 

虽然在临床试验期间停止了使用talirine的ADC，但两个使用相应的tesirine的ADC处于临床研究的高级阶段。Rovalpituzumab tesirine（Rova-T或SC16LD6.5）是由abbvie（Stemcentrx）开发的抗DLL3 ADC，在小细胞肺癌的III期临床试验中进行了测试。

ADC Therapeutics开发了loncastuximab-tesirine（ADCT-402）和camidanlumab-tesirine（ADCT-301），这两种药物都在关键的II期临床阶段分别针对B细胞急性淋巴细胞白血病和霍奇金淋巴瘤进行了测试。 

Genentech最近开发了一种新的抗CD22-NMS249 ADC，新的蒽环类化合物命名为PNU-159682。蒽环类药物是目前应用最广泛的化疗药物之一，在治疗侵袭性非霍奇金淋巴瘤（NHL）方面非常有效。该ADC使用MC-VC-PAB-DEA接头，带有一个加长的自锁间隔区，除了传统的PAB外，还包括N，N′-二甲基乙二胺（DEA）。在体内，这种抗CD22-NMS249 ADC在异种移植瘤模型中与抗CD22-VC-MMAE ADC一样有效，而在基于抗CD22-VC-MMAE ADC的细胞系的模型中仍然有效。证明了蒽环类ADC在治疗MMAE耐药癌症中的有效性。 

作为先前所述ADC的替代品，海德堡制药公司开发了一种称为ATAC（针对抗体靶向鹅膏蛋白结合物）的专利技术，该技术基于强RNA聚合酶II抑制剂。α-和β-鹅膏碱是两种著名的鹅膏毒素，在四十多年前的蘑菇中鉴定出来。HDP-101是由HDP30.2115（α-鹅膏蛋白的稳定类似物）通过组织蛋白酶B敏感连接物与靶向B细胞成熟抗原（BCMA，CD269）的硫单抗（由Genentech设计）定点偶联，产生DAR为2的ATAC。

BCMA已经成为治疗多发性骨髓瘤的一个非常有选择性的靶点。在体内，在多发性骨髓瘤的各种异种移植模型中，HDP-101导致小鼠肿瘤完全缓解，安全性研究在小鼠和猴子身上确定了一个非常有利的治疗窗口。ATACs是一类非常有前途的化合物，但目前仍处于临床前阶段。

第三代的成功典范：Enhertu和Trodelvy

在许多开发ADC的公司中，Immunomedics设计了一个令人惊讶的ADC，通过三重赌注：构建一个针对稍微过表达靶点的ADC，使用了一个混合了细胞内和细胞外释放的系统，以及比常规使用的有效载荷更弱的毒性药物。Sacituzumab-govitecan（IMMU-132）是一种抗TROP-2单抗，通过具有短聚乙二醇化单元的可裂解马来酰亚胺连接体与SN-38（伊立替康的活性代谢物）偶联。

FDA于2020年4月批准，这一成就令人印象深刻，因为这种ADC用于难治或耐药的三阴性乳腺癌（TNBC），之前没有有效的治疗药物。这种ADC的另一个有趣的特点是：包括聚乙二醇化单元的连接结构的优化使得该ADC的DAR高达7.6，而不会影响其耐受性或效率。DAR=4长期以来被认为是最佳的，但这一说法现在只适用于已知认可的ADC，其有效载荷为DM1或MMAE的第二代接头。

同样，为了使伊立替康衍生物与精心设计的连接体结合，日本第一三共公司开发了DXd（exatecan或DX-8951）。DXd是一种比SN-38体外对癌细胞活性高10倍的细胞毒性剂。DXd具有更好的安全性和最佳的溶解度，能够引起旁观者杀伤效应杀死邻近的癌细胞，这在异质性肿瘤中是一个优势，但半衰期短，可避免靶外毒性。

通过对蛋白水解敏感的马来酰亚胺连接体将DXd生物结合到抗HER2曲妥珠单抗半胱氨酸残基上，使得获得均匀DAR为7.7的共轭fam-trastuzumab-deruxtecan nxki（DS-8201a）。尽管DAR很高，但第一三共的DS-8201a在大鼠和猴子中的耐受性非常好，并且在血浆中非常稳定。 

DS-8201a能够在体内有效地将DXd输送到异质性肿瘤中，并显示出很高的治疗效果。去年，在转移性HER2阳性乳腺癌的III期临床研究中，DS-8201a成功地与T-DM1进行了比较，并最终于2019年12月底获得FDA批准。

ADC的毒性

Gemtuzumab-Ozogamicin

Gemtuzumab ozogamicin（Mylotarg）于2000年被FDA批准用于治疗某些急性髓细胞白血病（AML）患者。2001年，由于观察到静脉阻塞性疾病的病例，FDA发出了警告。2004年，一项随机研究比较了传统疗法以及与Mylotarg 联合的效果，结果由于后者死亡率的增加而提前停止试验。2010年Mylotarg从除日本外的大多数市场撤出。

由于第一次临床研究中可用的分析方法有限，Mylotarg后来才被确定为DAR方面的异质产品。虽然理论DAR值在2.5左右，但药物中50%以上的抗体没有被偶联，其他抗体的DAR值为4或5。同时，Mylotarg仅确定一个剂量的方案难以获得满意的治疗指数，不得不放弃开发。

然而，后续法国急性白血病协会（ALFA）的研究表明，将给药分为三个剂量，既提高了存活率，又没有发生严重不良事件。于是，Mylotarg于2017又重新获批上市。。

Brentuximab Vedotin

Brentuximab vedotin（Adcetris)于2011年被批准用于治疗某些表达CD30的淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤。然而，Adcetris作为单药治疗，临床上表现出潜在的严重周围神经病变、中性粒细胞减少症和血小板减少症，这是抗血小板药物的典型副作用。另一方面，观察到进行性多灶性白质脑病的罕见而严重的病例。

另外，Adcetris与博莱霉素（一种治疗霍奇金病的常用药物）联用，发现会导致不可接受的肺毒性，这种组合因此被排除。

ADC的典型或非预期毒性

根据ADC的有效载荷药物分类，如微管破坏剂（auristatins和maytansinoids）、抗有丝分裂抑制剂（KSPis）或DNA损伤药物（calichaemycin和PBD），某些毒性是可以预期观察到的。这些包括可达4级的骨髓毒性，敏感的神经和生长毒性。

另一方面，也报告一些在标准细胞毒性药物上没有观察到的的副作用。这些包括眼部毒性，如角膜炎或含有MMAF或DM4的ADC引起的角膜沉积物，这可能构成这些ADC药物的限制性毒性。Kadcyla已经证明会增加放射性坏死的风险。对这些非预期毒性的理解和管理对优化使用这些药物是至关重要的。

ADC耐药的机制

ADCs在肿瘤靶细胞水平上的作用机制包括几个阶段：与抗原结合，内化，药物释放（主要在溶酶体中），药物释放到细胞质中，药物作用于靶标诱导细胞凋亡。这些步骤中的每一步都可能与体外或体内的临床前研究所提示的抗药性有关：

（i）靶抗原的下调和/或抗体的结合、内化、运输或再循环缺陷；

（ii）ADC的溶酶体降解缺陷或溶酶体转运体如SLC46A3的表达减少，导致胞浆中有效载荷的释放降低；

（iii）微管蛋白或微管动力学调节剂的改变；

（iv）通过上调耐药转运体如MDR1减少药物在细胞内的滞留。

这些潜在耐药机制的临床相关性仍有待证实。事实上，在ADC治疗开始前和治疗后复发期间获取肿瘤样本是很复杂的。另外，在联合治疗的背景下，从其他药物中辨别抗ADC的耐药机制也同样复杂。

小结

在过去的十年中，ADCs已经通过选择更好的细胞毒性药物、生物偶联方法、更好的靶向抗原和优化的抗体工程得到了改进。然而，它仍存在一些局限性（如有限的实体瘤渗透性和毒性）以及耐药机制的出现。

为了克服这些局限性，人们研究了新的抗体形式、新的传递系统、非内化抗原靶点、新的细胞毒性药物和位点特异性生物偶联方法来促进ADC的发展。虽然许多创新尚未在临床方案中得到验证，但这一领域的研究为我们提供了许多令人鼓舞的结果。相信ADC未来的十年将会迎来更加辉煌的前景。

参考文献：

1. Antibody–Drug Conjugates: The Last Decade. Pharmaceuticals 2020, 13, 245