Cell：解锁胰腺再生新篇章：人类胎儿胰腺类器官的长期扩增与分化潜力

引言

胰腺是人体内一个复杂而重要的器官，承担着消化和内分泌的双重功能。然而，由于其组织构成的复杂性以及在实验室环境中长期维持功能性胰腺细胞的困难，针对胰腺的研究一直面临挑战。近年来，类器官（organoids）技术的发展为这一领域带来了革命性的突破。类器官是一种能够在体外重建器官结构和功能的三维细胞培养系统，为研究器官的发育、功能和疾病提供了理想的平台。

在胰腺研究中，如何获取具有多能性和分化潜力的干细胞是实现完整胰腺组织模型的关键。12月2日Cell的研究报道“Long-term in vitro expansion of a human fetal pancreas stem cell that generates all three pancreatic cell lineages”，通过分析人类胎儿胰腺组织，发现了一种特定的标记基因LGR5，其标记的干细胞不仅能够在体外长期扩增，还能分化为胰腺的三大主要细胞类型：腺泡细胞（acinar cells）、导管细胞（ductal cells）和内分泌细胞（endocrine cells）。这一发现为类器官技术的应用打开了新局面。

该研究的亮点在于从人类胎儿胰腺组织中成功建立了18种胰腺类器官（hfPOs），并通过单细胞RNA测序和其他前沿技术对其进行了深入分析。这些类器官能够在优化的培养条件下长期维持生长，并具有再现胰腺组织复杂性的能力，为糖尿病、胰腺炎等疾病的研究提供了崭新的工具。

胰腺作为消化和内分泌功能的重要器官，其复杂的结构和功能长期以来使其成为生命科学研究中的一大挑战。胰腺由腺泡细胞（acinar cells）、导管细胞（ductal cells）和内分泌细胞（endocrine cells）三种主要细胞类型组成，其中每种细胞类型都发挥着独特的生物学功能。近年来，类器官（organoids）技术的兴起为胰腺研究提供了全新的工具。然而，如何从人类胰腺组织中获得一种可以在体外长期维持并具备分化潜力的干细胞群，仍是科学家们亟待解决的难题。

在再生医学和疾病研究领域，类器官技术是一种新兴但非常有前景的研究手段。这种三维培养系统不仅能够模拟器官的形态和功能，还能在体外提供微环境支持，使干细胞能够分化成多种细胞类型。然而，早期研究主要集中于小鼠模型和体外诱导多能干细胞（iPSCs）的应用，在如何从人体组织中提取和扩增功能性干细胞方面尚有很大局限。该研究通过发现人类胎儿胰腺中的LGR5+（leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5）干细胞群，开发了一种能够在体外长期扩增并具备分化潜力的类器官系统。这一发现为类器官技术打开了新局面。

研究团队从孕期8至17周的胎儿胰腺组织中分离细胞，并通过优化培养基和生长条件，成功建立了18种人类胎儿胰腺类器官（hfPOs）。这些类器官能够在体外培养超过两年，并展现出分化为腺泡细胞、导管细胞和内分泌细胞的潜力，从而首次实现了人类胰腺三种主要细胞类型的体外生成。

从组织到类器官的构建

胰腺组织分离与培养条件优化

胚胎胰腺组织被分离后，研究人员将其嵌入基质提取物（BME）中，以提供三维支架支持。通过测试超过40种培养基组合，研究团队发现了一种特定的培养基配方（hfPO培养基），能够显著促进干细胞的增殖和分化。在培养过程中，通过手动挑选的方法，进一步筛选出具有分化潜力的芽状（budding）类器官。这些类器官表现出比囊泡状（cystic）类器官更高的多能性，能够在体外长期维持并稳定增殖。

hfPOs的建立过程及其基本特性（Credit: Cell）

(A) hfPO的建立流程 

图中展示了从人类胎儿胰腺组织中建立hfPO（胰腺类器官）的具体流程。研究人员从胚胎组织分离细胞，并将其嵌入基质提取物（如BME或Matrigel）中进行三维培养。经过培养条件优化后，成功生成了具有生长和分化潜力的类器官。

(B) hfPO1的生长过程代表性图像

白色箭头标示了类器官中芽状（budding）结构的出现，这是hfPOs生长过程中形成的特征性形态，代表了类器官的多能性和分化潜力。

(C) hfPOs在hfPO培养基中的明场图像

显示了成功建立的hfPO细胞系在hfPO培养基中的形态。这些类器官具有清晰的三维结构，进一步证明了其能够在特定条件下长期维持。

(D) 不同胚胎阶段hfPO的建立成功率

结果表明，来自第一和第二孕期的胎儿胰腺组织在hfPO培养基中的成功率存在差异。部分组织样本未显示明显生长（NG，no growth），而另一部分成功生成了类器官。

(E) 不同孕周胰腺组织的类器官生成能力

来自8、15和17孕周（gestational weeks, GW）的胰腺组织分别在haPO和hfPO培养基中培养。结果表明，hfPO培养基更适合促进类器官的生成和生长，尤其是具有分化潜力的类器官。

(F) hfPOs的长期培养能力

研究表明，hfPOs可以在体外长期培养并保持稳定性。其中，深蓝色线条代表芽状hfPO，浅蓝色线条代表囊泡状hfPO。每个标记点对应一次传代，表明这些类器官在培养过程中具有可重复的增殖能力。

(G) 组织学和免疫组化分析

使用苏木精和伊红染色（H&E）以及胰腺内分泌细胞标记物CHGA（chromogranin A）的免疫组化分析，对来源于8、15和17孕周胰腺组织的hfPO进行了评估。结果显示，芽状hfPO在结构和标记物表达上更接近胰腺组织，进一步支持了hfPO的功能性和多能性。

单细胞RNA测序与基因标记

研究团队采用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术对hfPOs进行分析，发现LGR5+细胞占据了干细胞层级的核心位置，且其基因表达模式与胎儿胰腺组织的干细胞高度相似。进一步分析表明，LGR5+细胞同时表达其他胰腺干细胞标记基因，如PDX1、SOX9等。这些标记物的表达显示，LGR5+细胞具备从干细胞分化为腺泡、导管和内分泌细胞的潜力。此外，研究人员还成功标记了LGR5+细胞，并追踪其在分化过程中形成类器官的动态变化。

分化实验与形态学分析

为评估hfPOs的多能性，研究团队分别将其置于促腺泡细胞分化（hfPO-AC培养基）和促内分泌细胞分化（hfPO-EC培养基）的条件中进行诱导培养。实验结果显示，在促分化条件下，类器官能够生成多种功能性细胞。例如，在hfPO-AC培养基中，腺泡细胞成功生成了胰蛋白酶（trypsin）、淀粉酶（amylase）等消化酶；而在hfPO-EC培养基中，内分泌细胞分泌了胰岛素（insulin）和胰高血糖素（glucagon）等关键激素。这些功能性细胞的生成通过免疫荧光标记和电子显微镜分析得到了进一步验证。

与胰腺组织的比较

通过单细胞转录组数据对比，研究人员发现，hfPOs在基因表达谱和细胞组成上与胎儿胰腺组织高度相似，尤其是在胰腺发育的早期阶段。例如，hfPOs在分化后表现出与胎儿胰腺一致的基因标记物表达模式，包括腺泡细胞的CPA1、PTF1A，导管细胞的KRT19，以及内分泌细胞的CHGA。这种相似性表明hfPOs能够在体外准确重建胎儿胰腺的细胞环境。

研究发现：胰腺类器官的多能性与应用潜力

LGR5+干细胞的核心作用

实验证实，LGR5+细胞是胰腺类器官的关键驱动力，其不仅具有多能性，还能够在体外长期扩增。通过单细胞分离和克隆培养技术，研究人员发现，LGR5+细胞在扩增过程中保持稳定的干细胞特性，并能够在适当条件下生成完整的类器官结构。

胰腺类器官的功能性验证

类器官生成的功能性细胞在多项测试中表现出与胰腺组织一致的功能。例如，腺泡细胞成功分泌了多种消化酶，包括胰蛋白酶和脂肪酶；内分泌细胞能够产生胰岛素和胰高血糖素，甚至可以分泌C肽（c-peptide）作为胰岛素生成的标志物。这些结果表明，类器官不仅具有形态上的分化能力，还能执行真实的生物学功能。

冷冻保存与长期培养

hfPOs在冷冻保存后表现出良好的复苏能力，并能够在复苏后恢复正常的增殖速度。这一特性为类器官的标准化和规模化应用提供了技术基础，也为建立类器官生物库奠定了重要的基础。

疾病模型与药物筛选的前景

胰腺类器官在疾病研究中展现出巨大潜力。例如，研究团队指出，通过调整培养条件，hfPOs可以被用作糖尿病、胰腺炎等疾病的模型，以研究病理条件下的胰腺功能变化。此外，hfPOs还可用于筛选针对胰腺疾病的候选药物，并测试其安全性和疗效。

类器官技术的突破性意义

胰腺类器官的成功培养标志着类器官技术在研究复杂器官方面的巨大进步。相比于传统的二维细胞培养系统，类器官能够更真实地模拟器官的三维结构、细胞间相互作用及功能特性。尤其是在胰腺研究中，hfPOs在再现腺泡、导管和内分泌三种主要细胞类型方面的能力，是其他模型系统难以企及的。

这种技术的一个重要应用前景在于疾病模型的构建。当前胰腺疾病如糖尿病、慢性胰腺炎和胰腺癌的研究仍然依赖动物模型或单细胞系，无法完全模拟人类胰腺的复杂性。hfPOs的出现为研究这些疾病提供了一个功能性更强且更贴近人类胰腺的体外模型。例如，通过引入致病基因突变，研究者可以在hfPOs中重建疾病特征，从而揭示胰腺疾病的发生机制。

LGR5+干细胞的潜力与争议

该研究通过LGR5标记确认了胰腺中的多能干细胞，这些细胞不仅能够长期扩增，还可以分化为胰腺的三种主要细胞类型。这一发现让LGR5+细胞成为胰腺再生医学的重要候选。然而，这一领域仍面临一些科学争议和技术瓶颈。

首先，LGR5+细胞的特性和功能是否适用于所有胰腺发育阶段或疾病条件仍需进一步验证。该研究中，LGR5+细胞主要来源于胎儿胰腺组织，其分化能力可能会受到发育阶段的限制。而成年胰腺中的LGR5+细胞是否具有类似的多能性，尚缺乏系统性的研究。此外，与小鼠模型相比，人类LGR5+细胞在基因表达、分化轨迹等方面可能存在重要差异，这需要更多的对比研究来确认。

其次，虽然LGR5+细胞在体外展现了很强的分化潜力，但如何在体内环境中复制这一过程仍是一个技术难题。胰腺细胞的分化受到多个因子的调控，包括生长因子、炎症反应和基质信号等。未来的研究还需要进一步探索如何在体内激活和引导这些细胞以实现胰腺的再生和修复。

类器官的局限性与改进方向

尽管hfPOs在功能性和多样性方面展现了极大的优势，类器官技术仍存在一些固有的限制。例如，当前的类器官培养主要依赖于外源性基质（如BME或Matrigel），这些材料在成分和来源上存在不确定性，难以实现临床应用的标准化。因此，开发合成的、化学成分明确的基质材料是未来类器官技术发展的重要方向。

此外，hfPOs中缺乏胰腺的非上皮成分（如血管、免疫细胞和神经组织），这限制了其在模拟复杂组织微环境方面的能力。胰腺功能的完整性依赖于不同类型细胞之间的协调作用，例如血管为内分泌细胞提供了营养和氧气，神经元调节了胰腺激素的分泌。因此，将类器官与微流控芯片技术结合，构建包含多种细胞类型的“胰腺芯片”，将成为类器官研究的重要延伸。

从基础研究到临床应用的转化潜力

该研究展现了hfPOs在基础科学和临床转化中的巨大潜力。例如，hfPOs可用于筛选糖尿病治疗药物，通过评估类器官在不同药物条件下的细胞行为和功能性分泌，可以大幅提高药物开发的效率和精准性。此外，在基因治疗领域，hfPOs也可以作为测试平台，用于验证基因编辑的效果和安全性。

更令人期待的是，hfPOs或将成为胰腺再生医学的核心工具。例如，通过将患者的诱导多能干细胞（iPSCs）分化为hfPOs，可以实现个性化的疾病模型和药物筛选；同时，基于基因编辑技术修复遗传缺陷后，这些hfPOs可能被用于移植，以恢复患者的胰腺功能。

综上，该研究不仅揭示了LGR5+细胞的关键作用，也为类器官技术在胰腺研究中的应用指明了方向。然而，这只是一个开端。未来的研究需要整合多学科技术，包括单细胞测序、基因编辑、合成生物学和人工智能，以推动类器官技术向更加复杂和精确的方向发展。

类器官的出现让我们看到了在实验室中重建人类器官的可能性，而hfPOs的成功培养则进一步证明了其在疾病研究和再生医学中的巨大价值。未来，随着技术的不断完善，这一领域的研究成果将不仅限于揭示生命的奥秘，还将在改善健康方面发挥更大的作用。

参考文献

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(24)01254-6

DOI: 10.1016/j.cell.2024.10.044