温州医科吴爱悯/国科温研院李花琼团队《AFM》: 基于酶促甲基丙烯酸角蛋白的可注射水凝胶用于椎间盘退变治疗中的可控外泌体释放

椎间盘退变(IVDD)作为引发腰痛的主要病因，其病理因素复杂多样，现有文献普遍认为其主要与生物力学性能丧失，炎症因子浸润，细胞外代谢失衡有关。外泌体治疗作为新兴的治疗手段近来在椎间盘退变研究领域大放异彩，但原位注射易泄露，单独注射稳定性差，无法恢复退变椎间盘的生物力学特性等缺点限制其在临床上的进一步转化。基于此，温州医科大学吴爱悯教授和国科温州研究院李花琼研究员团队在前期基础上开发一种以酶级联反应方式成胶的甲基丙烯酸角蛋白可注射水凝胶，并利用角蛋白存在的RGD序列锚定骨髓间充质干细胞（BMSC）来源的外泌体（Exo），以实现其可控释放，并最终应用于椎间盘原位注射达到延缓椎间盘退变的结果。相关工作以题为：“Injectable Hydrogel Based on Enzymatic Initiation of Keratin Methacrylate for Controlled Exosome Release in Intervertebral Disc Degeneration Therapy”的论文发表在《Advanced Functional Materials》上。

吴爱悯教授/李花琼研究员团队从人来源头发中分离角蛋白单体，并利用角蛋白上的胺基团与 2-甲基丙烯酸异氰酸乙酯（IEM）上的异氰酸酯基团之间的迈克尔加成反应，对角蛋白进行了 C=C 双键改性以实现力学性质改善。随后将该角蛋白甲基丙烯酸酯（KeMA）溶解与BMSC来源的Exo混合制备为预聚液，并在以葡萄糖/GOx/辣根过氧化物酶（HRP）为主体，乙酰丙酮（AcAc）和 N-乙烯基吡咯烷酮（NVP）为佐剂的引发体系下制备获得Exo@KeMA水凝胶。Exo@KeMA水凝胶通过恢复退变椎间盘的生物力学特性，释放Exo抑制NF-κB通路减缓炎症，促进PI3K-Akt通路恢复细胞外基质代谢平衡，最终实现延缓IVDD的目的。（方案1）

方案1. Exo@KeMA水凝胶的制备流程及作用示意图。

Exo@KeMA水凝胶表征测定

在构建KeMA水凝胶后，该研究团队首先对其主要酶促体系进行优化以获得最低酶促浓度，随后分离BMSC来源Exo进行装载，通过免疫荧光技术，活体成像技术验证KeMA水凝胶有效包封Exo，并延长其原位潴留，避免泄露。

图1. KeMA水凝胶体系表征测定及体系优化

图2. Exo@KeMA水凝胶制备及相关性质测定

Exo@KeMA水凝胶体外保护作用及作用机制探究

为了探究Exo@KeMA水凝胶是否具有调节细胞外基质代谢平衡及炎症抑制的能力，该研究团队首先构建IL-1β处理的髓核细胞（NPCs）模型以模拟体内的炎症环境，随后将Exo@KeMA水凝胶置于transwell小室内建立共培养体系，借助Western blot和免疫荧光技术检测其中NPCs内细胞外基质相关代表性指标Coll-2和MMP13以及炎症相关代表性指标IL-6和TNF-α的变化。结果显示Exo@KeMA水凝胶的确可以有效抑制炎症因子表达及分解代谢过程，同时促进合成代谢过程。该团队为进一步明确治疗作用的机制，同时针对共培养的NPCs进行RNA-seq测序，结果提示，炎症相关NF-κB信号通路被抑制，基质再生相关通路PI3K-Akt信号通路被激活。

图3. Exo@KeMA水凝胶可维持细胞外基质合成/代谢的平衡，减轻NPCs的炎症反应。

图4. Exo@KeMA可影响与 ECM 代谢和炎症相关的细胞通路。

体内验证Exo@KeMA水凝胶延缓IVDD的作用

该研究团队在进行体内实验前，先进行离体实验验证Exo@KeMA水凝胶能够模拟天然髓核状态，恢复相应的生物力学特性。随后构建针刺尾椎大鼠模型，并借助X线，MRI，HE，SO等技术手段验证Exo@KeMA水凝胶治疗效果。实验结果表明在原位注射Exo@KeMA水凝胶后大鼠椎间盘高度和髓核含水量得到恢复，椎间盘退变得到改善。

图5. Exo@KeMA水凝胶的机械支撑效果

图6. Exo@KeMA水凝胶的体内治疗效果

小结

综上所述，该研究团队制备的Exo@KeMA复合水凝胶通过恢复生物力学特性，并递送Exo以抑制NF-κB炎症通路激活，促进PI3K-Akt信号通路表达来实现延缓IVDD的目的。这一新型复合水凝胶系统为微创IVDD治疗提供一种新的治疗手段。

吴爱悯教授、李花琼研究员为共同通讯作者，温州医科大学附属第二医院2021级硕士生陈林杰和国科温州研究院彭可副研究员为共同第一作者，温州医科大学附属第二医院为第一通讯单位，国科温州研究院和温州医科大学为共同通讯单位。

该成果得到了国家自然科学基金面上项目，浙江省自然科学基金项目，国科温州研究院启动基金等项目的大力支持。

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adfm.202316545