IVD前沿丨3小时快速诊断血流感染及完成抗生素耐药测试

血流感染(BSI)是一种危及生命的急性疾病，表现为屏障功能(如皮肤或粘膜)的丧失，使细菌进入血液，引起炎症反应。大量研究表明，及时给予适当的抗生素对改善BSI的预后至关重要，但目前诊断BSIs的金标准是基于培养，诊断需要很长的检测周转时间(TAT)，大约36-72 h。因此，迫切需要制定策略，提供快速准确的BSI诊断，包括抗生素敏感性实验（AST）。

近日，杂志Communications Medicine上发表了一篇题为“Rapid diagnosis of bloodstream infections using a culture-free phenotypic platform”的文章。在本研究中，作者开发了RDAP，一种无需培养的表型检测平台，并证明了使用RDAP快速诊断BSI(包括AST)的可行性。RDAP在检测-识别和AST方面的诊断准确率分别为93.3%和95.4%，且至少快15小时提供结果。本研究的结果表明了一种为临床医生提供近实时诊断信息的方法，以显著提高BSI的治疗效果。

图片来源：Communications Medicine

主要内容

RDAP诊断平台概述

作者开发了一种电化学生物传感技术，即field effect enzymatic detection (FEED)，电压控制的信号放大。FEED已经证明可在皮摩尔水平进行葡萄糖检测。利用FEED的信号放大特性，作者开发了RDAP，一种无培养的表型检测平台，用于诊断细菌感染。RDAP系统是一种改进的电化学三明治免疫分析平台，其TAT最终仅受样品抗体孵育时间的限制。

在本研究中，作者使用RDAP对临床血液样本进行两类检测。首先执行同步检测-鉴定菌株，其次评估了快速AST (RAST)。在这个初步的临床可行性阶段，研究仅限于基于已经开发和表征的捕获/检测抗体对的7种特定细菌/菌株。但如果有特异性抗体，该系统可以很容易地适应于其他物种的检测鉴定。

同步检测-鉴定细菌种类/菌株

作者首先进行了同步检测-鉴定，检测临床样品中的特定细菌/生物体，并表明对其他细菌的检测特异性。采用大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、淋病奈瑟菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MSSA)和肺炎链球菌等7种细菌/物种特异性丝网印刷电极(SPE)进行同步检测。这一物种范围占所有BSI的57%。RDAP能够在16个样品中的15个中检测和识别正确的物种(准确率为93.8%)。未检出的一份样品细菌浓度仅为2 CFU/mL，低于目前的LOD 4 CFU/mL。在几乎所有情况下，只有针对目标细菌的SPE产生非零ΔI。在非目标SPE的ΔI值为非零的情况下，它们明显小于目标SPE的ΔI值（如下表）。同步检测-鉴定的典型TAT约为88 min。

RDAP的检测特异性进一步通过同时检测-鉴定对阴性临床血液样本进行检测，检测的10个样本中，每个样本都没有检测信号。结果表明没有交叉反应，因此具有更高的特异性。

同步检测-鉴定细菌种类/菌株的结果。

图片来源：Communications Medicine

RDAP在分离菌株上的AST检测

作者首先演示RDAP在分离菌株上执行AST的能力。作者从临床血液样本(BC1722)中分离出一株MRSA菌株，该菌株对头孢曲松和苯唑西林耐药，对万古霉素和克林霉素敏感。将低浓度菌株以不同浓度(0.25倍、1倍和5倍MIC)暴露于这些特异性抗生素中1小时，然后进行RDAP测定以确定细菌浓度。该MRSA菌株对每种抗生素的AST结果由其AIPs反映（如下图）。单次AIP的TAT为148 min(抗生素暴露1 h +同一浓度抗生素检测88 min)。

结果显示，RDAP平台的AST结果与MicroScan获得的结果一致。然而，产生结果的速度快了15小时。

RDAP在分离菌株上的AST检测结果。

图片来源：Communications Medicine

RDAP在未处理的临床全血样本上的AST检测

作者接着使用RDAP对未处理的临床全血样本进行快速AST（RAST），未经细菌分离和标准化，进一步缩短了TAT。含有4 CFU/mL大肠杆菌的临床血液样本(BC2229)的Microscan AST结果，该菌株对氨苄西林和庆大霉素耐药，对头孢曲松和美罗培南敏感。通过RAST显示了该菌株对这些抗生素的AIPs，证实了该菌株对头孢曲松和美罗培南的敏感性以及对氨苄西林和庆大霉素的耐药性（如下图）。同样，每次AIP的TAT为148分钟。

作者还对其他临床样本进行RAST，结果显示RDAP正确识别了42个样本中的40个样本的抗生素敏感性，准确率达95.4%。RAST通过消除菌种分离和标准化过程缩短了TAT。

RDAP在未处理的临床全血样本上的AST检测结果。

图片来源：Communications Medicine

RDPA平台的局限性

尽管RDAP在无培养诊断BSI方面的潜在临床应用已经得到证实，但目前该平台仍存在一些局限性。这里给出的结果是基于串行测量的。为了充分利用无培养方法，将需要多路复用能力来同时对多个样本进行测量(即并行测量)。目前，每个测量所需样本体积为300µL。对于用于检测-ID-AST诊断过程的样品的75次测量(15个ID目标，每个目标有5个AST)，所需的样本量将为22.5 mL，这与标准培养所需的典型血液体积(即10-30 mL)相当。到目前为止，只考虑了7种细菌(3种革兰氏阳性和4种革兰氏阴性)。具有抗体对的细菌特异性SPE的数量将需要扩大，以包括更多的病原体，期望达到所有BSI的95%。未来的临床研究将需要实时收集独立样本进行直接的时间-结果比较。与血培养相比，真正评估其敏感性和特异性需要更大的多中心研究。

总结与讨论

在本研究中，作者证明了RDAP用于包括AST在内的BSI近实时诊断的可行性。使用目前的平台，能够实现4 CFU/mL的检测限(LOD)，检测-鉴定时的TAT为88 min，AST仅需148 min。RDAP能够在16个样品中的15个样品中检测和识别正确的物种(准确率为93.8%)。未检出的样品细菌浓度仅为2 CFU/mL，低于目前的LOD。RDAP还正确识别了42个样本中的40个样本的抗生素敏感性，准确率为95.4%。

根据临床可行性研究中使用的临床血液样本队列结果，可得出结论:RDAP可以(1)在不进行培养富集的情况下，对含有常见BSI病原体的临床样本进行同时检测- 鉴定和AST;(2)通过抗生素暴露1小时实现快速准确的AST表型;(3)直接从血液样本中进行AST，而无需事先进行物种分离。这些特征有可能显著降低TAT，并随后为临床医生提供可操作的结果，允许在给予经验性广谱抗生素之前使用窄谱抗生素。目前，RDAP需要88分钟来执行检测-鉴定步骤，已经是一种接近实时的诊断方法。