Front Cell Dev Biol：中国学者发现机械乳化技术促进脂肪移植后再生的组织和分子变化

脂肪移植在组织修复和重建中的重要性日益得到认可，尽管其长期保留是众所周知的不可预测的，阻碍了其更广泛的临床应用。脂肪移植的成功取决于多种因素，主要是移植前的脂肪处理方法。广泛的研究一直致力于开发治疗或设计策略，以提高移植后脂肪保留率。最初的研究将保留脂肪的关键归因于脂肪细胞结构完整性和活性的保存，这一概念被称为细胞生存理论。然而，最近的研究将对脂肪形成的理解转向了“宿主细胞替代理论”，表明新生儿脂肪细胞主要是通过再生相关细胞的分化产生的。这种范式转变强调了探索创新方法的重要性，通过关注与再生相关的细胞机制来提高脂肪移植的寿命。

增强移植物再生的关键是获得更多的再生相关细胞，特别是脂肪组织来源的间充质基质细胞（ASCs）。大量培养ASCs的传统方法涉及使用胶原酶消化脂肪组织，这是一种不适合人类应用的技术。2017年，Yao等人开发了一种创新方法，通过机械剪切Coleman脂肪移植物产生凝胶状基质血管组分（SVF）脂肪。这种SVF凝胶富含再生相关细胞，如ASCs，在细胞治疗方面显示出相当大的前景。与传统方法不同的是，SVF凝胶技术采用纯物理方法—机械剪切，使其成为一种更安全的替代方法。传统方法依赖于胶原酶等酶消化剂，这会带来各种风险，如潜在的过敏反应和长期实验室培养过程中的细胞污染。这种方法有效地破坏了成熟的脂肪细胞，同时保留了干细胞的再生和分化能力。然而，剪切力增强SVF凝胶细胞再生的确切机制仍有待充分阐明。

在我们之前的研究中，我们利用流式细胞术比较了不同剪切力下的细胞亚群，阐明了细胞水平的变化，并证明了再生相关细胞的增加。我们发现，与传统的脂肪移植技术相比，通过机械剪切和缺乏酶消化产生的SVF凝胶实现了高效稳定的体积增强，并显著丰富了表达间充质干细胞标记物的群体。这表明SVF凝胶在临床移植中比传统Coleman脂肪具有明显的优势，包括减少成熟脂肪细胞和增加具有高再生潜力的细胞。包括我们在内的各种研究都使用免疫荧光染色来证明新的脂肪细胞起源于宿主来源的脂肪相关细胞。然而，脂肪移植研究的一个主要挑战在于它依赖于成像观察，而没有全面的分子分析。因此，通过分子生物学技术探索机械隔离诱导脂肪再生的机制对于推进该领域的发展至关重要。

为了弥补这一知识差距，我们对移植到裸鼠体内的Coleman脂肪和SVF凝胶样本的脂肪组织进行了转录组分析。该方法利用微阵列和RNA-seq作为强大的工具来剖析移植后脂肪再生差异的分子机制。基因表达表现出强大的动态，可以作为细胞内响应外部刺激的分子变化的实时指标。目前，微阵列或RNA-seq技术能够在全基因组范围内同时检测动态mRNA变化。我们使用这些方法来研究机械加工的SVF凝胶与未加工的Coleman脂肪移植后的分子事件。我们的目的是阐明机械剪切力促进脂肪组织再生的机制。

此外，本研究可能揭示通过战略性预处理提高移植脂肪保留率的特异性靶点分子，为提高脂肪移植治疗的疗效提供新的方向。

方法：本研究通过将抽脂患者吸出的脂肪（经科尔曼脂肪移植或通过机械剪切力进一步精制成SVF凝胶）移植到裸鼠背部来研究其作用机制。

基质血管组分（SVF）凝胶和Coleman脂肪的制备方案。通过离心抽吸脂肪来回收Coleman脂肪。SVF凝胶是通过选择性地保留含有油脂的上层，去除下层水层，然后施加压力以建立包裹的脂肪来获得的。这个程序之后是一个额外的离心步骤。这种制备涉及到使用纯手工技术，不依赖于任何外部物质。

各种脂肪的剪切力与运动粘度之间的关系。SVF凝胶是从最初的Coleman脂肪中获得的，在机械隔离期间使其受到剪切力。脂肪的粘度与剪切力呈正相关，两者之间存在显著的线性关系。

移植脂肪组织的总体外观、寿命和组织学改变。(A)用于实验的方法。(B)对两类脂肪移植物在移植后间隔3天和60天进行综合观察。(C)脂肪组织保存率的改变。与Coleman脂肪相比，SVF凝胶具有更高的保留率。*p < 0.001。(D)移植后60天的组织学分析显示右侧SVF凝胶内有组织的脂肪结构完全成熟，而左侧Coleman脂肪移植物中观察到残留的油滴。显微镜检查用比例尺设置为200 μm。符号“#”表示存在油滴。(E)免疫荧光染色显示，移植后3天，SVF凝胶移植物内的脂肪细胞出现坏死迹象，与Coleman脂肪移植物相比，perilipin染色阴性的区域明显增加。这表明SVF凝胶中的成熟脂肪细胞受到剪切力诱导的损伤。然而，移植60天后，在右下方的SVF凝胶移植物中观察到大量新形成的脂肪细胞，而在右上方的Coleman脂肪移植物中发现了多个缺乏perilipin染色的区域。这些发现表明SVF凝胶中脂肪细胞新生的发生率较高，Coleman脂肪中脂肪细胞坏死的情况较多。显微镜检查用的比例尺尺寸为100 μm。

流式细胞术定量测定不同组织间充质干细胞的相对丰度。流式细胞分析结果显示，与在Coleman脂肪中观察到的相比，SVF凝胶中间充质干细胞的丰度显著增加，差异超过8倍

通过对SVF凝胶组和Coleman脂肪组的移植组织进行微阵列和RNA-seq分析，确定移植早期的组织来源。(A)第三天移植脂肪组织的人cDNA微阵列的点阵图显示杂交信号质量较低。该示意图基于本研究中SVF凝胶组获得的样品。(B)背景校正后抽脂后直接分析的人体组织高质量杂交信号。图示样本是最近获得的未接受任何移植治疗的Coleman脂肪标本。(C)热图显示了单个基因的表达水平，从绿色到红色表示低到高水平。(D)右侧灰框显示了前10个显著富集的生物过程/类别，以及相应数量的参与脂质代谢和细胞周期过程的上调/下调表达基因。

结果：移植后SVF凝胶的保留率超过了Coleman脂肪。苏木精和伊红（HE）染色和免疫荧光结果表明，SVF凝胶组可以形成新的脂肪组织，其特征是组织良好的成熟脂肪结构。施加机械剪切力诱导间充质干细胞丰度增加。移植后脂肪再生，而不仅仅是存活再生，再生细胞主要来自小鼠，微阵列分析支持了这一点。RNA-seq显示在SVF凝胶组和Coleman脂肪组之间表达了601个基因，其中164个基因上调（细胞周期过程），437个基因下调（脂质代谢）。

讨论:机械剪切力的应用可以减少并发症的风险和促进细胞增殖和分裂,从而提高移植脂肪的保留和再生。

原始出处：

Yuan, Ye;  Jian, Ma;  Bing-Yang, Guo;Mechanical force promotes tissue and molecular changes in adipose tissue regeneration post-transplantation.Front Cell Dev Biol 2024;12(0):1472575