基因密码神来之笔 “重磅”流感疫苗诞生记
2018-01-15 佚名 药明康德
疫苗诞生之前的历史，是一部战争与瘟疫交织的历史。数千年来，人类在微生物面前，常常扮演着一个被动迷茫的弱者。许多致命病原体的攻击，更让死神像秋风扫落叶一般，戕害无数手无寸铁的生灵。当历史的车轮驶向近代的地平线，天花疫苗终于横空出世。从中国的人痘接种术，到英国的牛痘接种法在全球推广，世界各地千百年来反复爆发的天花病毒，终于在几十年前被人类彻底消灭。此后，脊灰糖丸、卡介苗、乙肝疫苗等相继推广，也在不
疫苗诞生之前的历史，是一部战争与瘟疫交织的历史。数千年来，人类在微生物面前，常常扮演着一个被动迷茫的弱者。许多致命病原体的攻击，更让死神像秋风扫落叶一般，戕害无数手无寸铁的生灵。当历史的车轮驶向近代的地平线，天花疫苗终于横空出世。从中国的人痘接种术，到英国的牛痘接种法在全球推广，世界各地千百年来反复爆发的天花病毒，终于在几十年前被人类彻底消灭。此后，脊灰糖丸、卡介苗、乙肝疫苗等相继推广，也在不同程度上抑制了致命病毒和细菌，疫苗的防范普及由此为人类医学发展史掀开了崭新的篇章。
图片来源：波士顿儿童医院网站
然而，免疫探索之路依然任重道远。流感病毒是最容易影响普通人健康的病原体之一，而小小的流感病毒所导致的恐慌和威胁，也从未停下过侵扰人类的脚步。至今，治疗流感尤其是重症患者的药物疗效依然有限，流感疫苗仍是普通人群最应关注的预防手段。北大药学院院长周德敏带领团队利用密码子扩展技术，通过修改病毒基因编码和多重诱导病毒突变实验，研制出一种全新复制缺陷型活病毒流感疫苗，彻底突破了减毒、灭活、亚单位片段等传统疫苗的研发模式，该成果也被《科学》杂志列为去年年全球十大科学突破之一。这种高效、低风险、抗突变的疫苗模式，不仅是人类震慑流感病毒的希望，更为我们最终攻克其他痼疾带来革命性曙光。
周德敏教授1996年完成北医大与日本筑波大学联合培养博士课程，之后在Scripps研究所师从PeterG.Schultz教授进行博士后训练，现任国家973“基于基因密码子扩展的蛋白质标记新方法”首席科学家，以及天然药物及仿生药物国家重点实验室系主任，并于2017年12月获得药明康德生命化学研究奖杰出成就奖。
密码子扩展术：全抗原活疫苗不是神话
Q：传统疫苗存在着感染风险、接种效果不佳、难以应对病毒突变等多种挑战。您团队研制出的全新流感疫苗如何克服这些挑战，并体现出独特优势？
周德敏教授：传统疫苗分为减毒、灭活、亚单位、载体疫苗等种类。常见的减毒疫苗注射到人体之后，病原体仍可以在体内复制，如果遇上抵抗力低下的宿主则可能恢复毒力。传统灭活疫苗不会导致接种者感染，但病毒蛋白结构在灭活过程中一旦被破坏，则可能难以达到理想的接种效果。某些亚单位流感疫苗采用病毒表面少量膜蛋白片段，其接种效果有时也差强人意。
流感病毒基因由八个片段组成，每个片段都包含上百个密码子。我们的技术要点概括起来非常简洁：就是将某些基因位点的密码子修改为终止密码子（三碱基UAG），即在天然细胞的环境内，使病毒在关键基因位点停止翻译蛋白质，从而成为失去传代能力。因此这种全抗原疫苗完整保存了病毒的结构和感染力，可以在接种人体内诱导高效的免疫应答，但是无法复制的病毒对人体造成的风险则降到最低。
流感病毒表面的包膜会分布了大约500个血凝素刺突（HA）和100个神经氨酸酶刺突（NA）。这两类刺突都属于糖蛋白，每一个刺突理论上都可能突变，所以高突变率是疫苗研发的严峻挑战。为了应对挑战，我们最大可能性模拟了诱导病毒基因突变的内外环境：即模拟人体内部多种免疫通路，以及模拟达菲、金刚烷、干扰素等常用抗病毒药物的外部化学环境，让弱流感病毒疫苗实现多种负反馈性的耐药性突变。目前我们已经证实了弱流感疫苗甚至可应用于预防强流感。
Q：过去曾有学者通过其他技术制备复制缺陷型病毒疫苗，但转基因病毒仍存在恢复为野生型病毒的风险。密码子扩展技术如何防止病毒通过基因突变恢复丢失蛋白，并实现疫苗疗效的迭代升级？
周德敏教授：我们团队完成了对弱流感病毒的全基因扫描，有的基因位点密码子修改为UAG容易导致该病毒返祖，但是我们也发现了不容易导致返祖的基因位点，将3个以上这样的位点密码子修改为UAG，则病毒不再出现突变回野生型病毒的风险。在小鼠实验阶段，我们将把1000个野生流感病毒注入10只小鼠鼻腔，10天之后老鼠全部死亡；把1亿个加装UAG病毒的疫苗注入小鼠体内，10天后小鼠保持健康且体内可检测到相关病毒的“全抗原“。
我们的文章投递到《科学》杂志之后，有一个编委成员表示，尚未发病的流感病毒携带者，如果不慎接种这类新型疫苗是否会产生不良反应？没想到这个提问，竟然促使我们实现了从预防性疫苗到治疗性疫苗的飞跃！众所周知，多数疫苗为预防性疫苗；治疗性疫苗所针对的人群存在不同程度的免疫禁忌、免疫无能或者免疫耐受。所以要研发治疗性疫苗，必须通过更为巧妙的方式改造靶抗原的结构和组合，使其相似又相异于预防性疫苗的靶抗原，从而有效打破和逆转患者的免疫耐受状态。
我们发现随着病毒基因密码子突变为UAG的位点增多，小鼠患病后再接种相应的病毒疫苗，则清除野生病毒的能力逐渐提升。当疫苗内病毒基因密码子突变为UAG的位点达到4个，患病小鼠接种该疫苗之后则体内不会在检测到野生流感病毒。原来，野生病毒受到疫苗中转基因病毒的质粒侵染，也被迫带上了UAG这个终止密码子的枷锁！这样的疫苗研制方法不仅对于临床有重要的转化价值，更有利于病毒学的基础研究：通过体外培养，我们是否能够预测出一种病毒究竟能产生多少种突变？每一种基因突变与环境之间具体有怎样的联系？
神奇细胞系：非天然氨基酸合成工厂
Q：您团队研制的全新疫苗如果接种在哺乳动物体内，病毒无法实现细胞内复制。那么该病毒如何实现在体外的大规模制备，并最终投入临床转化和市场应用呢？
周德敏教授：在天然细胞中，病毒利用宿主细胞内的天然氨基酸合成蛋白质、进行复制，需要相应的天然转运RNA（tRNA）和氨酰-tRNA合成酶（aaRS）。而天然细胞内并没有能与UAG这个密码子匹配的转运RNA，所以UAG才会扮演终止密码子的角色。因此经过基因改造的活病毒疫苗，才不会在接种人群细胞内中复制。
然而终止密码子其实只是一个相对的概念。如果我们在模式细胞内整合加入特殊的基因，使该细胞表达能够与UAG匹配的转运RNA，则UAG将不再是终止密码子。然后我们再在模式细胞内整合加入特定氨酰-tRNA合成酶基因，则转基因病毒便可以在特殊的细胞环境内，启动UAG密码子，并利用非天然氨基酸合成蛋白质、完成复制。
我们耗费两年时间才成功培养出特殊细胞系，这恰恰是实现密码子扩展技术的关键步骤，也是我们能够大规模制备这种复制缺陷型病毒的核心技术。经过最初的环境适应，这种细胞系目前长势良好。作为完美的病毒包装载体，这个特殊细胞系具有重大的理论研究价值，我们还将探索其基因组、转录组测序特征，研究基因修饰细胞与正常生物体细胞之间的区别。
Q：基因密码子扩展技术在您研究的其他方向中，还有哪些重要的应用？
周德敏教授：地球上绝大多数生物体内的蛋白质翻译过程，由61个密码子和3个终止密码子执行，其中61个密码子产生20种天然氨基酸，并组成无数种不同的蛋白质。密码子扩展技术，旨在将生物体内闲置的终止密码子变身为有义密码子，从而让生物体合成出含有更多种类氨基酸的蛋白。非天然氨基酸最重要的作用是实现蛋白质定点修饰和标记。天然蛋白质由20种氨基酸进行排列组合，但能进行化学交联反应的氨基酸种类却很少，常用的结合位点为赖氨酸。多数蛋白质含有多个赖氨酸位点，如果需要对蛋白质进行偶联，则修饰物/标记物可能会被随机结合在任意一个赖氨酸位点。若某个蛋白质包含具有特殊反应活性的非天然氨基酸，则偶联反应会发生在特定氨基酸位点，从而实现可控的精准修饰。
我们利用这一技术已实现腺相关病毒（AAV）的非天然氨基酸定点标记及靶向修饰，有望催生新一代的靶向基因疗法。AAV病毒宿主范围广、病原性低、携带的治疗基因表达期长，是基因疗法常用的转染载体之一。利用非天然氨基酸标记方法，可以进一步提升AAV病毒的细胞特异性、减少其对靶细胞之外的感染风险，从而提升转染效率。我们还是将终止密码子引入AAV病毒，并让其在模式细胞中表达出包含非天然氨基酸的蛋白质，从而使蛋白质可以定点定量引入多种修饰分子。
我们选择脑胶质瘤为该疗法研究对象，通过让AAV病毒载体表达出环形RGD（精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸）分子，引导病毒靶向整合素高表达的脑胶质瘤细胞。另外AAV病毒基因组还整合了HSV-TK（单纯疱疹病毒胸苷激酶）自杀基因，所以这种疗法大大提升了靶向杀伤脑胶质瘤细胞的能力。目前细胞实验阶段已经结束，我们将在下一阶段启动动物实验模型。
整合酶基因裂变：艾滋病疫苗研发的新靶标
Q：您目前在研的疫苗主要覆盖哪些疾病？未来您的团队还有哪些具体的研究发展方向？
周德敏教授：在疫苗研究领域，我目前主要是研发弱流感疫苗以预防其他重型流感，之后我们还会继续开发H1N1、H3N2、H5N1、H7N8型流感疫苗。除此之外，我们还会利用同样的方式研发EV71型手足口病、非典、埃博拉病毒疫苗。这些都是游离复制型病毒的疫苗，即病毒基因组以游离质粒方式自行复制，而不整合入宿主细胞基因组。
同时我们也已经启动了针对整合型病毒疫苗的研制，整合型病毒包括HIV等逆转录病毒。而HBV（乙肝病毒）、HPV（人乳头瘤病毒）等既可以游离态复制，也可整合到宿主细胞基因组并导致高危的癌变风险。这类病毒疫苗研发的靶标，是病毒整合入宿主基因组所需要的整合酶：我们在整合酶蛋白基因编码的特殊位点加上终止密码子，则整合酶无法翻译表达，这类病毒便无法整合进入宿主基因组，从而杜绝疫苗在人体内导致感染的风险。尽管这类病毒突变速率较快，但我们相信依据游离复制型疫苗的研发经验，我们有希望找到重大疾病的有效预防手段。
Q：在多年的学习和科研过程中，您有幸遇到国内外名师的指导。在科学精神的传承中，您有哪些特别的感触？
周德敏教授：我在国内的研究生课程中师承张礼和院士，学习药物全合成和天然产物合成。但老师站得高看得远，他很早就认识到生物制药发展的潜力，所以建议我进行日语培训。之后我有幸前往日本接受博士联合培养计划，并学习分子生物学。在日本我的进步很快，将生物和化学的界限打通，许多曾经困扰自己的问题豁然开朗，在1年半的时间里就在《JACS》、《PNAS》杂志上发表了好几篇重要论文。
正是有了跨界的知识积累，帮助我将不同领域的新技术组合，然后再产生自己的原创性突破。突破需要找到方法，更需要有敢于突破的勇气。面对失败的实验，不应该气馁或质疑自己，而应当坚持创新的想法，并且在失败中看到机遇。也许前人也遇到过同样的失败，却没有从中汲取成功的灵感，所以我们应当珍惜这样反败为胜的机遇。回国之前我曾在药企工作，负责过一个shRNA文库建设项目，当时我发现依据某一权威论文的数据进行实验却反复出现问题，我并未因无法重复权威实验而气馁，相反经过长时间实验和反复推敲，发现这篇论文中的关键环节错误，之后也有其他学者发表纠错论文证实了自己的想法。所以只要坚持对基础科学深入研究，一定能从失败中找到原因并产生新的发现。
优秀的老师教会我如何做人、做科研，而今作为博导和院系主管，我也希望将科研精神传承下去。另外我认为在实验课题的推进过程不能急功近利，3-5年的时间很正常；而对研究生的培养也不局限于传授知识，而是要给予同学们充分的主动权；和年轻学生在一起工作，我会让自己保持开放的心态，而不是墨守陈规，这样才能发挥名校优秀学生的聪明才智，让整个团队在攻克科学难题的道路上不断实现新的突破，为人类健康带来更多福祉
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