最新Nature大子刊：大幅减少基因编辑副作用！

当实行基因组编辑时，Cas9核酸酶在DNA中会产生靶向双链断裂。后续的DNA修复途径可能导致较大的基因组缺失（大于100 bp），而这限制了基因组编辑的适用性。

在此，首尔大学Sangsu Bae等人发现Cas9介导的双链断裂在癌症细胞系、人类胚胎干细胞和人类原代T细胞中以不同频率诱导较大的缺失，并且大多数缺失是由两种修复途径产生的：末端切除和DNA-聚合酶-θ介导的末端连接。这些发现需要优化长程扩增子测序，开发用于同时分析大DNA缺失和小DNA改变的k-mer比对算法，以及使用CRISPR干扰筛选。尽管利用了产生单链断裂的突变Cas9连接酶，碱基编辑器和素数编辑器也产生了较大的缺失，但频率比Cas9低约20倍。相关工作以“Large DNA deletions occur during DNA repair at 20-fold lower frequency for base editors and prime editors than for Cas9 nucleases”为题发表在Nature Biomedical Engineering。

【文章要点】

尽管CRISPR核酸酶产生的大多数缺失都短于20个碱基对（bp），但有研究观察到CRISPR-Cas9诱导的小鼠胚胎中超过20%的突变是长度超过250 bp的意外缺失。此外，CRISPR核酸酶诱导的DSB可以诱导染色体重排，包括染色体耗竭和易位。CRISPR-Cas9系统的另一种变体是使用碱基编辑器（BE）和素数编辑器（PE），它们使用部分失活的Cas9（nCas9），产生单链缺口。然而，这些基于nCas9的基因组编辑系统是否也会产生大的缺失尚不清楚。识别在用Cas9或nCas9进行基因组编辑后产生大缺失的修复途径，不仅可以提供对这一过程生物学的关键见解，还可以制定缓解缺失事件的策略。然而，使用短程高通量测序方法确定>100 bp的缺失事件频率具有挑战性。目前，这些事件是通过使用短读测序仪（如Illumina平台）的长程扩增子测序方法或使用太平洋生物科学公司（PacBio）或牛津纳米孔技术公司（ONT）平台的长读测序方法来检测的。而在这项研究中，作者改进了一种长程扩增子测序方法，并开发了一种新程序，使用名为Expanded Cas-Analyzer27（ExCas Analyzer）的专用k-mer比对算法同时分析CRISPR系统产生的大缺失和小突变，最终可准确地确定了CRISPR诱导的大缺失（图1）。

图1 远程深度测序方案

研究观察到，在人类细胞系中，包括癌样细胞（HeLa、HEK293T、U2OS、K562）、成纤维细胞、原代T细胞和人类胚胎干细胞（H9），大的缺失大多伴随着小的indel。然后，作者通过使用ONT纳米孔测序的CRISPR干扰（CRISPRi）筛选实验确定了与大缺失相关的修复途径，确定TMEJ是产生大缺失的主要途径。研究发现，BE通过碱基切除修复（BER）途径产生大的缺失，特别是在存在无嘌呤/无嘧啶位点（AP位点）的情况下，PE在存在额外的切割导向RNA（ngRNAs）的情况下尤易产生大的删除。这些研究结果揭示了使用基因组编辑工具的机制挑战，并为在研究和治疗应用中避免这些问题提供了见解（图2）。

图2 不同细胞系的突变频率

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41551-024-01277-5