Nature：开辟治疗之路：反义寡核苷酸在蒂莫西综合征治疗中的突破

引言

蒂莫西综合征是一种严重的多系统障碍，表现为自闭症、癫痫、长QT综合征以及其他神经精神疾病。特别地，蒂莫西综合征1型（TS1）由钙通道蛋白CACNA1C基因上的特异性剪接异构体增益功能变异所致。这种异构体在发育过程中有高表达，导致钙通道功能失调，从而影响神经细胞的电生理特性和迁移能力。

4月24日Nature报道了一项新的研究“Antisense oligonucleotide therapeutic approach for Timothy syndrome”，该研究主要探讨了蒂莫西综合征（Timothy syndrome, TS）的一种潜在的基因疗法。研究团队开发了一种基于反义寡核苷酸（Antisense Oligonucleotides, ASOs）的治疗策略，该策略能够有效降低8A剪接体的包含量，从而增强8剪接体的表达。实验结果表明，这种基因调控策略不仅能在体外细胞模型中改善由TS1引起的细胞缺陷，还可以通过体内模型进一步验证其疗效。研究使用的人类皮层类器官体和前脑组装体模型，显示经ASO处理的神经细胞显示出正常的迁移和电生理功能。

这项研究的意义在于，它提供了一种可能的治疗神经发育障碍的新策略，并且这种策略是基于精确的基因剪接调控。这对于那些由单一基因变异引起的疾病具有重要的启示意义，特别是在当前对这类疾病缺乏有效治疗方法的情况下。通过进一步的研究，这种方法有可能为治疗蒂莫西综合征乃至其他类似的神经精神疾病提供一种新的解决方案。

Highlights

创新的基因疗法策略

该研究通过开发一种新型的基于反义寡核苷酸（Antisense Oligonucleotides, ASOs）的治疗方法，针对蒂莫西综合征（Timothy syndrome, TS）中特定的基因变异进行精准治疗。这种方法专门降低了特定剪接异构体的表达，从而可能纠正与疾病相关的钙通道功能异常。

多模型验证疗效

研究不仅在体外的细胞模型中验证了ASOs治疗的效果，还在体内的动物模型中展示了其潜在的临床应用价值。特别是通过使用皮质类器官体（cortical organoids）和前脑组装体（forebrain assembloids）这两种模型，研究进一步确认了基因疗法的疗效和生物学效果。

对神经发育障碍治疗的前景

该研究的方法不仅可能对蒂莫西综合征的治疗提供新的方向，而且对于其他多种神经发育障碍症（neurodevelopmental disorders）的治疗也展示了潜力。这标志着一种全新的治疗突破，可能改变未来治疗这类疾病的策略。

精确调控基因表达

研究中采用的ASOs技术允许研究人员以前所未有的精确度调控基因表达，特别是在调节疾病相关基因的特定剪接变体方面。这种精细调控为复杂遗传性疾病的治疗提供了新的可能。

Strategies

反义寡核苷酸（Antisense Oligonucleotides, ASOs）开发

研究团队设计了特定的ASOs来靶向CACNA1C基因中的8A外显子，旨在通过改变剪接模式来减少这一外显子的包含。这一策略基于前期的分子生物学研究，通过体外实验确定哪些ASOs最有效地降低8A外显子的表达。

体外细胞模型测试

使用从TS患者诱导的多能干细胞（iPSCs）衍生的神经细胞，研究团队进行了ASOs处理。这些细胞在特定条件下培养，然后用ASOs处理，观察其对电生理特性和细胞行为的影响。

体内动物模型实验

研究进一步通过将人类皮质类器官体（human cortical organoids）移植到无菌小鼠模型中来评估治疗策略的效果。这些类器官体在处理ASOs后，移植到动物模型中，通过观察其在动物体内的行为和整合情况来评估其潜在的临床应用。

生物成像与电生理分析

对处理过的细胞和组织进行详细的生物成像和电生理测试，包括使用钙成像（calcium imaging）技术来评估细胞的电生理活动，以及使用高分辨率显微成像来观察细胞结构和迁移特性的变化。

Behind the Scenes

蒂莫西综合征（Timothy syndrome）

蒂莫西综合征（Timothy syndrome）是一种极为罕见的遗传性疾病，它主要影响心脏、手脚的发育以及神经系统。这种综合征的特征包括严重的心律失常（QT间期延长），这可能导致突发的昏迷甚至死亡。此外，患者还可能表现出手足发育异常（如多指症）、面部特征异常、免疫系统问题、以及神经发育障碍，例如自闭症谱系障碍。

蒂莫西综合征由CACNA1C基因的突变引起，这个基因负责编码体内的钙通道。钙通道在很多体内过程中都扮演着重要角色，包括心肌细胞的正常功能和神经信号的传递。

蒂莫西综合征极为罕见，目前报道的病例非常少。据估计，全球范围内可能只有几十个确诊病例。

相关里程碑

疾病的首次描述（2004年）：蒂莫西综合征最初由 Katherine W. Timothy 等人描述，因此得名。这一发现标志着这种罕见病的临床识别，为后续的研究和诊断提供了基础。

基因突变的发现（2004年）：几乎同时，研究人员发现蒂莫西综合征与CACNA1C基因的突变有关。CACNA1C基因编码一种重要的钙通道蛋白，这种钙通道在心脏和神经系统的功能中扮演关键角色。这一发现揭示了疾病的分子基础，对于开发针对性的治疗方法具有重要意义。

病理机制的阐释：随着对CACNA1C基因功能和影响的进一步研究，研究人员开始理解这种钙通道如何影响心脏功能和神经发育，从而导致蒂莫西综合征的各种表型。这有助于开发更有效的治疗策略，例如使用特定的钙通道阻断剂来减轻症状。

研究模型的开发：为了更好地研究蒂莫西综合征及其治疗方法，研究人员开发了多种疾病模型，包括遗传改造的小鼠模型。这些模型使研究人员能够在实验室环境中模拟疾病的发展过程，评估潜在的药物和治疗方法的效果。

蒂莫西综合征的治疗

目前主要是对症处理和预防并发症，由于其罕见和复杂性，没有特定的治疗方法可以治愈该疾病。治疗手段包括：

心脏问题的管理：使用β-阻断剂等药物来控制心率和预防心律失常。在某些情况下，可能需要植入心脏除颤器或起搏器来管理严重的心律失常。

神经发育支持：针对神经发育延迟或自闭症谱系障碍的症状，提供早期干预、物理治疗、语言治疗和职业治疗等支持。

手足畸形的矫正：在必要时进行手术矫正多指症等手足畸形。

综合照护：由于蒂莫西综合征患者可能会有多系统受累，因此需要多学科团队合作，包括心脏病学家、神经科医生、遗传顾问等，以提供全面的医疗支持。

治疗的难点

疾病的罕见性：由于蒂莫西综合征极为罕见，相关的研究和资源较少，这限制了对疾病深入理解和治疗方法的发展。

症状的多样性：患者之间的症状差异大，这使得制定统一标准的治疗方案变得复杂。

管理复杂的并发症：心律失常、神经发育问题和身体畸形的管理需要综合多方面的医疗知识和技能，对医疗提供者来说是一个挑战。

长期照护需求：患者需要长期甚至终生的照护和监控，这对患者家庭和医疗系统都是一种负担。

CACNA1C基因与蒂莫西综合征

CACNA1C基因在蒂莫西综合征中的作用非常关键，它编码L型钙通道的一个主要亚单位，称为α1C亚单位。这种L型钙通道主要存在于心脏和大脑中，对于调控钙离子流入细胞内部起着至关重要的作用。钙离子是许多细胞活动的关键信号分子，包括肌肉收缩、神经信号传递和激素分泌等。

在蒂莫西综合征的情况下，CACNA1C基因的突变通常会导致钙通道的功能异常，具体机制如下：

钙通道打开时间延长：CACNA1C基因突变导致的一个主要效应是增加钙通道的打开时间。正常情况下，这些通道在接收到信号后会快速开启并关闭，以精确控制钙离子的流入。但在蒂莫西综合征中，突变导致这些通道关闭延迟，使得更多的钙离子进入细胞。

钙离子超载：由于钙通道打开时间延长，细胞内的钙离子浓度增高，导致钙离子超载。这种超载对细胞功能产生广泛影响，尤其是在心脏和神经系统中。

心脏功能受影响：在心脏中，钙离子超载会干扰正常的心脏节律和收缩功能，导致QT间期延长（心电图上显示心室复极化延迟）和其他严重的心律失常。

神经系统发育问题：在大脑中，钙离子流的异常也可能干扰正常的神经发育和神经信号传递，这可能是蒂莫西综合征患者出现认知障碍和自闭症谱系障碍的原因之一。

反义寡核苷酸（Antisense Oligonucleotides, ASOs）

ASOs是一种基于基因治疗的方法，它能够特异性地调控基因表达。这种方法利用了短的、单链的核酸分子来干扰特定的信使RNA（mRNA）的功能，从而抑制疾病相关蛋白的产生或改变蛋白的功能。

原理

结合特异性: ASOs是设计来与特定的mRNA序列互补的短链核苷酸。当ASOs与其目标mRNA结合时，它们通过碱基配对原则形成稳定的双链结构。

干预mRNA的功能: 结合后，这种双链结构可以通过多种机制来阻断mRNA的正常功能。最常见的机制之一是促使mRNA降解。这通常是通过诱导RNase H酶活性实现的，该酶识别这种双链结构并切割mRNA链。

抑制蛋白质合成: 通过降解mRNA或阻止其翻译，ASOs可以有效减少疾病相关蛋白的合成，从而发挥治疗作用。

其他作用机制: 除了促进mRNA降解外，ASOs还可以通过改变剪接事件来调节蛋白质的产生。例如，某些ASOs能够修改剪接过程中的选择性剪接位点，从而产生有益的蛋白质变体或避免有害的蛋白质表达。

重要里程碑

1987年，第一个反义寡核苷酸药物（Vitravene, fomivirsen）开始进行临床试验。这标志着ASO技术从实验室研究转向实际的医疗应用。

1998年，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了Vitravene（fomivirsen）用于治疗由CMV（巨细胞病毒）引起的视网膜炎。这是第一个获得批准的反义药物，为ASOs在药物开发领域的应用开辟了道路。

2006年，FDA批准了Mipomersen，这是一种用于治疗遗传性高胆固醇血症的ASO药物。这一批准进一步验证了ASO技术在治疗复杂的遗传性疾病中的潜力。

2016年，Spinraza（Nusinersen）成为第一个被FDA批准用于治疗脊髓性肌肉萎缩症（SMA）的药物。该药物通过调节基因剪接来增加功能性SMN蛋白的产生，这是ASOs应用的一个重大突破。

近年来，更多基于ASO的疗法得到开发和批准，如用于治疗杜氏肌萎缩症（Duchenne Muscular Dystrophy, DMD）的Eteplirsen和用于治疗遗传性淀粉样变病的Inotersen等。

开发和挑战

ASOs技术已被用于治疗多种遗传性和获得性疾病，包括但不限于肌萎缩侧索硬化症（ALS）、多发性硬化症（MS）和某些遗传性疾病。这种技术的一个关键优势是其高度的特异性，能够精确靶向疾病相关的基因，从而减少不良反应并提高疗效。此外，ASOs的设计和合成相对容易，允许针对多种疾病快速开发定制治疗方案。尽管ASOs技术具有高度的潜力，但在临床应用中也面临一些挑战：

递送问题: ASOs必须进入细胞内部才能发挥作用，因此其递送效率是治疗成功的关键。目前，研究人员正在研究多种方法来提高ASOs的细胞内递送，例如使用纳米粒子、脂质体等载体。

稳定性和持久性: 在体内环境中，未经修饰的ASOs可能很快被降解。为了提高其稳定性，ASOs通常会进行化学修饰，如磷酸酯化等，这有助于提高其在体内的半衰期。

选择性和副作用: 虽然ASOs设计时具有高度的特异性，但错误的靶向或非特异性结合仍可能导致副作用。因此，优化ASOs的序列以最小化脱靶效应是研究的一个重点。

监管和审批: ASOs作为一种新型治疗方法，需要经过严格的临床试验和监管审批过程。确保治疗的安全性和有效性对于获得监管机构的批准至关重要。

皮质类器官体（cortical organoids）和前脑组装体（forebrain assembloids）模型

在该研究中，皮质类器官体（cortical organoids，hCO）和前脑组装体（forebrain assembloids，hFA）被用于评估治疗策略对神经疾病的影响。通过使用来自特定Timothy综合症的患者细胞创建的这些模型，研究人员能够模拟疾病的分子和细胞特征，并评估药物干预的效果。

研究中，hCO被移植到新生大鼠的感觉皮层中。这些器官体在移植后能够生长并发展成熟的细胞类型，这些细胞能够整合进入大脑的感觉和动机相关回路。实验通过使用前向引物靶向外显子7和反向引物靶向外显子9的PCR产物来分析。此外，实验还展示了ASO在移植模型中通过减少异常的外显子8A的表达，从而修复离子通道缺陷和细胞内钙流动的缺陷。

hFA模型通过合并两种不同类型的器官体（hCO和hSO，即皮质和纹状体类器官体）来构建，以模拟更复杂的脑区间交互作用。实验中评估了ASO对于这些组装体中的细胞迁移的影响。使用了钙成像技术和盐运动长度测量，研究表明ASO处理能显著改善TS模型中的神经元迁移缺陷，具体体现为改善细胞运动缺陷和细胞间的钙动力学。

这些模型被认为具有显著的潜力，尤其是在模拟人类大脑的复杂交互作用以及测试新的治疗方法方面。

模拟人类大脑的复杂性

组织复杂性：皮质类器官体和前脑组装体能够复制人类大脑的三维结构，包括多种类型的神经细胞和支持细胞。这些细胞在器官体中可以自组织成类似于实际大脑的微环境，形成具有区域特异性的层和结构。

功能性：这些模型不仅能够展示细胞的生长和分化，还能够展现细胞间的电活动和网络连接。例如，研究已经表明，皮质类器官体能够产生类似于大脑的同步振荡模式，这对研究神经网络的功能和病理极为重要。

测试治疗方法的有效平台

药物测试：由于这些模型展示了与人脑类似的药理反应，它们成为了药物筛选和毒性测试的理想工具。这是因为它们能够反映出人类细胞对药物的具体反应，而非依赖于动物模型的预测，这些动物模型可能在生理和遗传层面与人类存在差异。

基因编辑：基因编辑技术（如CRISPR-Cas9）可以在这些模型中使用，以研究特定基因变异对大脑发育和功能的影响。这对于理解遗传性神经疾病的根本原因和发展针对这些病变的治疗策略具有重要意义。

实验研究支持

疾病模拟：通过基因编辑产生的带有疾病特定突变的皮质类器官体和前脑组装体，为研究诸如自闭症谱系障碍、神经退行性疾病等复杂病症提供了有价值的见解。这些模型帮助研究人员理解疾病是如何从分子层面影响大脑结构和功能的。

疗效评估：在这些模型中测试药物和基因疗法的效果，能够提供关于治疗策略在真实人类细胞条件下的实际效果的直接证据。

多模式研究的重要性

该研究通过结合体外（in vitro）模型，如皮质类器官体（cortical organoids）和前脑组装体（forebrain assembloids），与体内（in vivo）模型进行研究，这种策略能够增强对神经精神疾病的理解。这种组合方法在神经科学研究中尤为重要，尤其是在研究那些在传统动物模型中难以模拟的人类特有的病理生理特征时。

体外模型提供了一个可控的环境，可以详细观察细胞行为和基因表达，特别是在神经发育早期。例如，通过皮质类器官体可以观察到在神经系统发育中特定基因如何影响细胞命运和层次结构的形成。

体内模型，如基因修饰小鼠模型，提供了一个整体生理环境，可以研究神经网络如何在整个生物体中功能性地运作和相互作用。

例如，研究人员使用人类诱导多能干细胞（hiPSCs）导出的神经前体细胞移植到小鼠大脑中，成功地观察了这些细胞如何在一个活体环境中整合并参与网络活动，这证明了体外和体内模型结合使用的有效性。

许多神经精神疾病，如自闭症和精神分裂症，在传统的动物模型中难以复制人类特有的病理特征。使用体外人类细胞模型可以更准确地模拟这些疾病的人类特异性病理过程。

潜在的局限性

研究中提到未来的研究应该探索ASO序列和化学修饰、内源前体mRNA（pre-mRNA）水平、细胞类型的背景以及潜在的脱靶效应对治疗效果的影响。此外，疗效的评估也需要更多的数据支持。

人类大脑组织的获取困难，特别是对于在胎儿期就开始表现的疾病，如TS，这一点对开发治疗方法构成了实质性挑战。

尽管使用了人类患者衍生的三维多细胞模型进行了体内外研究，但动物模型的不可用或不能完全再现人类病理生理学仍是一个问题。这对于研究其他神经精神疾病及评估治疗的效率和安全性也有重要影响。

潜在的研究方向

该研究强调了ASOs在纠正如TS这样的遗传性疾病中的治疗潜力，通过调节基因中特定外显子的剪接来实现。未来的研究可以专注于改进这些分子，以获得更好的特异性和降低毒性，将这种策略扩展到TS之外的其他神经精神和神经发育障碍。未来的研究还可探索ASOs的系统效应，考虑到目标蛋白如CaV1.2（钙通道1.2）的广泛表达。

需要进一步的研究来验证ASO疗法在体内的长期安全性和有效性。这包括开发改进的传递系统，确保ASOs有效且一致地到达其目标组织。患者反应的可变性和潜在的脱靶效应仍是关键挑战。

将基于ASO的疗法与CRISPR/Cas9等其他新兴技术以及先进的药物传递系统结合，从而开发更加强大和精确的治疗方法。研究可以探索如何优化这些组合，以增强治疗效果并最小化不良反应。

随着这些疗法向临床应用进展，解决基因修饰治疗的伦理、法律和社会影响至关重要，特别是在可及性、患者同意以及潜在的非预期遗传变化方面。

原文链接

Chen X, Birey F, Li MY, Revah O, Levy R, Thete MV, Reis N, Kaganovsky K, Onesto M, Sakai N, Hudacova Z, Hao J, Meng X, Nishino S, Huguenard J, Pașca SP. Antisense oligonucleotide therapeutic approach for Timothy syndrome. Nature. 2024 Apr;628(8009):818-825. doi: 10.1038/s41586-024-07310-6. Epub 2024 Apr 24. PMID: 38658687; PMCID: PMC11043036.

https://www.nature.com/articles/s41586-024-07310-6