Nature：人类神经类器官细胞图谱：揭开脑发育与疾病的关系

引言

在人类大脑的深奥结构中，隐藏着无数未解的谜团。研究人员一直致力于解开这些谜团，但大脑的复杂性和难以获得的样本使得这一过程充满挑战。近年来，神经类器官技术的出现为研究大脑提供了一种全新的工具——这些微型“类大脑”模型可以在实验室中重现人类大脑的关键特征，帮助研究人员揭示大脑发育、疾病发生机制，以及神经系统如何形成和运作。通过这些类器官，研究人员得以观察神经元如何连接、网络如何建立，甚至如何模仿某些神经疾病的病理过程。11月20日 Nature 的研究报道“An integrated transcriptomic cell atlas of human neural organoids”深入探讨了神经类器官的最新进展，包括它们在基础研究和疾病模型中的应用，并展示这些“微型大脑”如何在推动神经科学领域的进步中发挥重要作用。从细胞图谱的构建到疾病模型的应用，类器官的研究正在不断拓展我们对人类大脑的理解，开创前所未有的研究可能性。

神经类器官是通过干细胞在特定的条件下，在体外环境中形成的三维神经组织模型。与传统的二维细胞培养相比，类器官更能反映体内的生理条件，因而成为研究大脑发育和病理的理想模型。

类器官提供了对人类大脑发展和疾病研究的独特视角。大脑结构极其复杂且难以采样，这使得类器官成为一种不可替代的工具。例如，研究人员可以利用特定的形态素（morphogens）引导类器官的发育方向，生成特定脑区的细胞类型，这称为“引导性培养”（guided protocol）。而在自发性培养（unguided protocol）中，类器官可以通过自组织能力生成多样化的细胞类型。

神经类器官不仅在形态上类似于发育中的大脑，还在功能上展现了大脑的某些特征。例如，研究表明，类器官中的神经元可以形成复杂的神经网络，表现出自发的电活动，这些特性使得它们成为研究神经网络形成和突触可塑性的理想工具。

单细胞RNA测序与细胞类型分析

单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）是解析类器官细胞组成和异质性的重要工具。通过scRNA-seq，研究人员可以精确识别神经类器官中的各种细胞类型，包括神经祖细胞（neural progenitor cells, NPCs）、神经元以及胶质细胞。

在该研究中，研究团队整合了来自26种不同神经类器官培养的36个单细胞转录组数据集，共计1.77百万个细胞。这些数据集涵盖了从培养7天到450天的类器官，采用了多种单细胞测序方法，如10x Genomics、Drop-seq、Smart-seq2等。整合这些数据的目的是构建一个完整的人类神经类器官细胞图谱（Human Neural Organoid Cell Atlas, HNOCA），以便评估类器官中的细胞类型与人类大脑发育参考图谱的相似性。

scRNA-seq技术不仅用于鉴定细胞类型，还可以帮助研究人员研究细胞之间的通讯机制。通过分析细胞之间的配体-受体相互作用，研究人员揭示了类器官中不同细胞类型之间的信号传递网络，这对于理解大脑发育过程中细胞间的相互作用至关重要。

人类神经类器官细胞图谱（HNOCA）的整合和构建过程（Credit: Nature）

HNOCA 构建的概览：从不同数据集中收集数据、数据处理和整合的工作流程，包括一致的预处理和严格的质量控制，以确保数据的一致性和可靠性。

UMAP 可视化：HNOCA 中的细胞通过UMAP进行了可视化，展示了不同细胞类型的注释，包括神经祖细胞（NPCs）、中间祖细胞、神经元等。还包括选定标志基因的表达、样本的年龄，以及分化类型。

细胞类型的比例：在 HNOCA 中不同细胞类型的分布，每个堆叠条形图表示一个生物样本，按数据集和样本年龄顺序排列，顶部显示了36个数据集、类器官分化方法和类型，底部显示了样本的年龄。

细胞状态流的可视化：根据细胞状态的变化趋势推断出的细胞状态向成熟细胞的流动，使用顶级扩散成分（DC1）进行着色，箭头显示了细胞状态的流动方向。

伪时间分析：沿着皮层伪时间的标志基因表达变化也被展示，以进一步揭示类器官发育过程中细胞的分化路径。

非端脑神经元的群集和基因表达热图：通过对非端脑神经元的亚群进行聚类，展示了这些群体的基因表达情况，使用热图来表示不同基因在这些细胞群中的相对表达水平。

神经类器官细胞图谱的构建

在构建HNOCA的过程中，研究团队进行了全面的数据整理、整合和注释工作。这包括从36个数据集中收集详细的技术和生物学元数据，经过一致的预处理和严格的质量控制，最终得到了一个覆盖多个大脑区域的细胞图谱。

构建细胞图谱的过程包括以下几个步骤：

1.数据收集与整合：共收集了36个单细胞数据集，涵盖引导性和自发性培养的多种类器官培养方法。

2.细胞类型的自动注释：研究团队开发了名为“snapseed”的工具，用于基于标志基因的细胞类型注释，并结合“scPoli”工具进行标签感知的数据整合。通过这些工具，类器官的细胞类型被归类为不同的群体，包括神经祖细胞、神经元和胶质细胞等。

整合的数据通过UMAP进行可视化，揭示类器官中多条神经分化轨迹，包括背侧端脑和腹侧端脑的神经元发育路径，以及神经祖细胞向星形胶质细胞和少突胶质细胞的分化。例如，引导性培养的类器官中，背侧端脑兴奋性神经元比例较高，而自发性培养的类器官则表现出更为多样化的细胞类型。

类器官中特定标志基因的表达进一步验证了这些分化轨迹。例如，背侧端脑的标志基因EMX1和TBR1在引导性培养中表现出显著表达，证明了这些细胞与相应大脑区域的相似性。这些数据表明，类器官能够有效模拟大脑特定区域的发育过程。

研究人员还对类器官中的细胞周期状态进行了详细分析，发现不同培养时间和条件下细胞的增殖和分化模式存在显著差异。通过细胞周期相关基因的表达分析，研究表明，在早期培养阶段，类器官中有大量增殖的神经祖细胞，而随着培养时间延长，神经元和胶质细胞的比例明显增加。这些发现为我们理解类器官中的细胞动态变化提供了关键证据。

HNOCA 数据与人类发育大脑参考图谱的比较（Credit: Nature）

UMAP 可视化：人类发育大脑细胞图谱的 UMAP，可视化了不同神经元亚型（NTT）、区域标签以及细胞类别的分布。类似地，也展示了 HNOCA 中神经元的映射亚型和不同区域标签，如神经祖细胞（NPCs）、中间祖细胞（IP）和神经元的分布。

热图分析：图c 是一个热图，显示了来自不同发育阶段的类器官细胞和原始大脑细胞之间的匹配程度，反映了类器官在不同年龄与不同发育阶段的对应关系。通过比较 HNOCA 细胞与一到三孕期以及婴儿期、青春期人脑的发育参考图谱，研究人员揭示了类器官细胞发育成熟的动态过程。

细胞类型的分布与比例：图d 展示了不同数据集中来自不同脑区（如端脑、中脑、间脑、后脑）的神经细胞比例，展示了引导性和自发性培养类器官生成特定脑区细胞的能力。

细胞状态的表示：UMAP 分析还用于显示在 HNOCA 数据集中的原始脑细胞类型或状态的表现程度。低分数表示在 HNOCA 数据集中较少表现的细胞状态，例如一些特定脑区的细胞在类器官中的表现欠缺(。

不同发育阶段的类器官相似性：研究团队比较了类器官细胞和人脑不同发育阶段（从一孕期到青春期）的细胞转录组特征，发现随着类器官培养时间的延长，细胞逐渐向更成熟的状态转变，但与晚期阶段的细胞并无显著匹配。

与人类大脑的相似性

通过与人类大脑发育参考图谱的对比，研究人员们评估了神经类器官与真实大脑的相似性。整体上，神经类器官中生成的细胞类型与人类大脑发育过程中的相应细胞在转录组特征上高度相似，这证明了类器官作为研究模型的可靠性。然而，类器官中的某些细胞类型与其对应的原始体之间存在差异。对920个普遍差异表达基因的分析表明，类器官中的神经元相较于其原始大脑细胞，表现出更高的糖酵解和线粒体ATP合成活性。尽管这种代谢应激在一定程度上影响了类器官的转录特征，但并未改变神经元的核心分子身份。因此，类器官仍然是研究人类大脑发育的有效模型。

为了进一步量化类器官与人类大脑的相似性，研究人员计算了细胞类型之间的相似性得分。结果表明，引导性培养的类器官中，细胞类型与相应大脑区域的相似性得分平均为0.85，而自发性培养的相似性得分为0.78。这些定量结果表明，引导性培养在模拟特定脑区分化方面更为有效。

此外，研究团队通过电生理学分析验证了类器官的功能相似性。他们发现，类器官中的神经元不仅在形态上与大脑神经元相似，还能够形成功能性突触并产生自发的神经活动。通过钙成像技术，研究人员观察到类器官中神经元的同步钙信号，这与体内神经网络的活动模式相似。这些结果为类器官在功能层面上的忠实度提供了直接证据，证明其在神经功能研究中的巨大潜力。

神经类器官在神经疾病模型中的应用

除了研究大脑的正常发育，HNOCA还为神经类器官在神经疾病模型中的应用提供了基础。在该研究中，研究人员收集了11个单细胞转录组数据集，涵盖了自闭症、阿尔茨海默病等10种神经疾病模型，总计409,000个细胞。他们将这些数据投射到HNOCA中，以注释细胞类型并进行差异表达分析，找出可能与这些疾病相关的基因和路径。

例如，在脆性X综合症（fragile-X syndrome, FXS）模型中，研究人员们发现了一些在FXS细胞中高表达的基因，如CHD2，这些基因与自闭症相关。此外，FXS模型中的神经祖细胞和神经元主要表现为端脑身份，而对照组细胞则主要表现为非端脑身份。在阿尔茨海默病模型中，涉及突触功能和神经炎症反应的基因（如SYN1和TNF）在疾病相关神经元中显著上调，这些数据揭示了神经疾病的分子机制。

这些研究结果表明，类器官不仅可以再现大脑的正常发育过程，还能够模拟病理条件下的细胞变化，从而加深对复杂神经疾病的理解，推动新治疗方法的开发。例如，在帕金森病类器官模型中，研究人员发现与线粒体功能和神经炎症密切相关的分子途径，这些途径在帕金森病多巴胺能神经元中表现出异常，为寻找新的治疗靶点提供了线索。

此外，类器官还被用于药物筛选平台，以评估新药物对神经元存活和功能的影响。由于类器官能够模拟复杂的细胞相互作用，它们为药物有效性和毒性研究提供了更具生理相关性的模型。在阿尔茨海默病类器官中进行的药物筛选研究中，初步验证了一些候选药物对神经炎症和神经退行性病变的抑制效果，为个性化治疗和新药开发提供了广阔的前景。

神经类器官的未来应用

人类神经类器官研究正在迅速发展，未来将有更多的单细胞转录组数据产生。因此，HNOCA也将持续更新，以确保对新数据的有效整合和对发育模型的改进。在该研究中，研究人员们开发了“HNOCA-tools”计算工具包，使得其他研究人员可以复现这些分析，进一步推动神经类器官领域的发展。

未来，随着基因编辑技术（如CRISPR-Cas9）与类器官技术的结合，研究人员将能够在类器官中进行精准的基因操作，模拟特定遗传突变对大脑发育和功能的影响。这使得神经类器官成为探索神经疾病遗传基础的理想平台。研究人员可以研究特定基因突变如何导致神经元发育异常，从而加深对自闭症、精神分裂症和帕金森病等疾病的理解。

此外，类器官与体内移植技术的结合也逐渐成为研究热点。通过将人类神经类器官移植到小鼠大脑中，研究人员可以观察类器官在体内环境中的整合及其与宿主神经元的相互作用。这种“类嵌合体”模型为类器官在复杂生理环境中的功能评估提供了宝贵的机会，并为开发基于类器官的细胞治疗方法铺平了道路。

总的来说，HNOCA作为一个整合类器官细胞图谱，展示了类器官在研究大脑发育和神经疾病方面的巨大潜力，并为开发新型培养体系和改进模型提供了宝贵的资源。随着类器官研究的发展，我们对人类大脑复杂性的理解将进一步加深。同时，类器官作为药物筛选和基因功能研究的重要工具，其应用前景无疑将不断扩展，推动神经科学领域的新突破。

参考文献

He, Z., Dony, L., Fleck, J.S. et al. An integrated transcriptomic cell atlas of human neural organoids. Nature 635, 690–698 (2024). https://doi.org/10.1038/s41586-024-08172-8