苏州大学殷黎晨Sci.Adv：吸入免疫抗菌剂治疗慢性阻塞性肺病！

慢性阻塞性肺病（COPD）急性加重期的有效治疗方式和药物给药策略尚不充分。在此，苏州大学殷黎晨开发了一种免疫抗菌剂（IMAMs），旨在结合抗菌治疗和促进炎症消退的免疫疗法。IMAMs由头孢他啶（CAZ）包裹的空心介孔二氧化硅纳米颗粒（HMSNs）构建，并通过可变电荷/构象的多肽进行门控。这种多肽在中性pH下呈现负电荷、随机卷曲的构象，遮盖HMSNs的孔隙以防止抗生素泄漏，并允许雾化的IMAMs高效穿透支气管粘液和生物膜。在生物膜的酸性环境中，多肽转变为带正电荷的刚性α螺旋，增强生物膜的保留并揭开孔隙以释放CAZ。同时，多肽被条件性激活，以破坏细菌膜并清除细菌DNA，作为CAZ的辅助剂来根除定植于肺部的细菌，并抑制Toll样受体9（TLR9）的激活以促进炎症消退。这种免疫抗菌策略可能会改变当前COPD管理的范式。该研究以题为“Inhaled immunoantimicrobials for the treatment of chronic obstructive pulmonary disease”的论文发表在《Science Advances》上。

图1展示了免疫抗菌剂（IMAMs）穿透粘液和生物膜进行COPD免疫抗菌治疗的示意图。IMAMs由头孢他啶（CAZ）封装在空心介孔二氧化硅纳米颗粒（HMSNs）中，并通过可变电荷/构象的多肽进行门控。在中性pH条件下，多肽呈现负电荷和随机卷曲构象，这有助于IMAMs在雾化后高效穿透粘液和生物膜。一旦进入生物膜的酸性环境，多肽会转变为带正电荷的刚性α螺旋，这不仅增强了生物膜的保留，还揭开了HMSNs的孔隙以释放CAZ。同时，这种结构转变激活了多肽，使其能够破坏细菌膜并清除细菌DNA，作为CAZ的辅助剂，共同消除肺部定植的细菌，并抑制Toll样受体9（TLR9）的激活，促进炎症消退。这些特性使得IMAMs成为一种有前景的治疗COPD的策略，可能改变当前COPD管理的范式。

图1.IMAMs穿透粘液和生物膜用于COPD免疫抗菌治疗的示意图

【IMAM的制备和表征】

图2展示了IMAMs的制备和酸触发的构象转变特性。通过在HMSNs表面引入带有正电荷的季铵胺和负电荷的羧基的多肽，制备了带有负电荷的随机卷曲构象的多肽修饰的纳米颗粒（MEK^CA NPs）。这些多肽在中性pH下由于侧链间的静电吸引而呈现负电荷，而在酸性环境中，羧基被去除，多肽转变为带正电荷的刚性α螺旋，从而揭示了HMSNs的孔隙以释放封装的CAZ。这一转变过程伴随着颗粒尺寸的增加和ζ电位由负转正，以及在pH 6.5下CAZ的累积释放率显著提高。这些结果表明，IMAMs能够在酸性生物膜环境中实现药物的按需释放，同时多肽的构象转变增强了对细菌膜的破坏能力，有助于清除肺部定植的细菌并促进炎症消退。

图2.IMAM的表征和酸触发转化

【MEK^CANPs在体外和体内的粘液渗透】

图3展示了IMAMs在体外和体内的粘液穿透能力和肺组织分布。研究首先评估了Cy5标记的MEK^CA NPs（^Cy5MEK^CA NPs）在囊性纤维化（CF）患者的脓性痰液中的传输效率，发现负电荷的^Cy5MEK^CA NPs的传输效率是正电荷^Cy5MEK NPs的八倍。通过多粒子追踪（MPT）实验，观察到^Cy5MEK^CA NPs在CF痰液中的布朗运动范围显著大于^Cy5MEK NPs，有效扩散系数（Deff）也显著提高。此外，通过光漂白实验验证了^Cy5MEK^CA NPs在粘液中的扩散行为，发现其在光漂白区域的荧光强度下降与NPs的扩散效率呈负相关。在体内，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察到，^Cy5MEK^CA NPs能有效穿透粘液屏障，主要分布在肺上皮的深层区域，而^Cy5MEK NPs则主要定位在杯状细胞上方，表明^Cy5MEK^CA NPs在粘液穿透方面具有显著优势。这些发现共同证实了MEK^CA NPs在体外和体内均表现出良好的粘液穿透能力，这主要归因于它们对粘液吸附的抵抗性。此外，MEK^CA/CAZ NPs在雾化后表现出良好的稳定性，尺寸未发生变化，CAZ释放水平低。

图3. IMAM 的粘液渗透和肺潴留

【MEK^CA/CAZ NPs的生物膜渗透和抗菌效率】

图4展示了IMAMs在体外对生物膜的穿透能力和抗菌效率。研究制备了P. aeruginosa生物膜，并用Cy5标记的NPs进行观察，结果显示负电荷的^Cy5MEK^SA NPs在生物膜中的积累几乎可以忽略，而^Cy5MEK NPs的红色荧光随着深入生物膜而显著减弱，表明正电荷NPs与EPS基质有较强的静电吸引，限制了其在生物膜中的穿透。相比之下，^Cy5MEK^CA NPs在整个生物膜中分布明显，穿透深度超过2.7微米，这得益于酸触发的电荷反转从负到正。随后，研究了NPs的抗菌效率，发现MEK^CA NPs在pH 6.5时能有效杀死大肠杆菌、P. aeruginosa和金黄色葡萄球菌，而在pH 7.4时MIC显著升高，表明MEK^CA NPs在酸性条件下具有条件性抗菌效率。非可转换的MEK^SA NPs在pH 6.5时也表现出较弱的抗菌能力。此外，DL-MEK^CA NPs由于其α螺旋结构的强膜破坏活性，对三种测试菌株的MIC比MEK^CA NPs高四倍。FE-SEM观察显示，MEK^CA NPs处理后细菌膜破裂变形，表明NPs上的阳离子螺旋多肽能有效通过破坏细菌膜来杀死细菌。封装抗生素CAZ后，MEK^CA/CAZ NPs在pH 6.5时表现出更强的抗菌效果，与自由CAZ和MEK^CA NPs相比，MIC显著降低。这些结果表明，MEK^CA NPs不仅具有强大的生物膜穿透能力，还能通过酸触发的构象转变和膜破坏活性，以及与抗生素的协同作用，有效消除肺部定植的细菌。

图4.IMAMs的体外生物膜渗透和抗菌活性

【MEK^CANP介导的cfDNA清除和体外抗炎作用】

图5展示了IMAMs在体外对细胞游离DNA（cfDNA）的清除和抗炎效果。研究首先通过收集急性加重期COPD（AECOPD）患者的痰液，发现与健康志愿者相比，AECOPD患者的痰液中cfDNA水平、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和一氧化氮合酶（iNOS）水平显著升高，且cfDNA水平与AECOPD的严重程度呈强相关性。接着，研究了MEK^CA NPs在pH 6.5时对cfDNA的清除效率，结果显示MEK^CA NPs能显著降低痰液中的cfDNA水平，主要通过阳离子多肽与cfDNA之间的强静电相互作用。进一步分析cfDNA的组成，发现MEK^CA NPs处理前后细菌DNA与总cfDNA的比例保持不变，但细菌DNA的组成有所变化，这可能是因为革兰氏阳性菌的厚细胞壁阻碍了细菌DNA的释放。此外，MEK^CA NPs还能有效清除细菌gDNA，阻止TLR9途径的激活，从而抑制免疫细胞的异常激活。在HEK-Blue mTLR9细胞中，MEK^CA NPs显著降低了gDNA诱导的TLR9激活。在中性粒细胞和巨噬细胞中，MEK^CA NPs处理后，gDNA激活的中性粒细胞数量和分泌的TNF-α及IL-6水平显著降低。这些结果表明，MEK^CA NPs不仅具有杀菌活性，还能通过清除细菌DNA来抑制炎症，为COPD管理提供了一种新的策略。

图5.IMAMs的体外cfDNA清除和抗炎功效

【MEK^CA/CAZ NP介导的体内抗菌作用】

图6展示了IMAMs在COPD小鼠模型中的抗菌和抗炎效果。研究首先建立了COPD小鼠模型，通过吸烟处理、气管内脂多糖（LPS）挑战和P. aeruginosa感染。随后，COPD小鼠接受了MEK^CA/CAZ NPs的雾化治疗。结果显示，MEK^CA/CAZ NPs显著减少了BALF中的细菌菌落数量，与CAZ治疗相比，MEK^CA/CAZ NPs处理后细菌菌落数量显著减少，接近未感染小鼠的水平。此外，MEK^CA/CAZ NPs显著降低了血清和肺组织中的促炎细胞因子水平，包括TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8，优于单独的MEK^CA NPs和CAZ。这些发现表明，MEK^CA/CAZ NPs在COPD小鼠中具有显著的抗菌和抗炎效果，能够有效地消除肺部定植的细菌并减轻肺部炎症，这可能有助于改善COPD小鼠的病理生理状态。

图6.IMAMs在COPD小鼠中的抗菌和抗炎功效

【MEK^CA/CAZ NP介导的体内炎症消退】

图7展示了IMAMs在COPD小鼠模型中促进炎症解决和肺功能恢复的效果。研究中，COPD小鼠在接受了MEK^CA/CAZ NPs的雾化治疗后，BALF中的总细胞计数显著减少，特别是中性粒细胞和巨噬细胞的浸润显著降低，接近健康小鼠的水平。MEK^CA/CAZ NPs还有效地将巨噬细胞从促炎的M1型极化转变为抗炎的M2型，同时恢复了肺组织中其他免疫细胞如辅助T细胞和细胞毒性T细胞的正常水平。此外，MEK^CA/CAZ NPs治疗显著改善了COPD小鼠的肺功能，包括动脉血氧分压（PaO₂）的升高、动脉血二氧化碳分压（PaCO₂）的降低以及血液pH值的改善。这些结果表明，IMAMs不仅能够抑制免疫细胞的浸润，防止免疫细胞向促炎表型分化或极化，而且能够促进有效的炎症解决，为COPD的治疗提供了一种新的策略。

图7.IMAM介导的COPD小鼠炎症消退和肺功能恢复

【小结】

该研究开发了一种新型的免疫抗菌剂（IMAMs），它结合了抗菌治疗和促进炎症消退的免疫疗法，用于治疗慢性阻塞性肺病（COPD）的急性加重期。IMAMs由头孢他啶（CAZ）封装在空心介孔二氧化硅纳米颗粒（HMSNs）中，并通过可变电荷/构象的多肽进行门控。这种设计使得IMAMs能够在酸性生物膜环境中实现药物的按需释放，同时多肽的构象转变增强了对细菌膜的破坏能力，有助于清除肺部定植的细菌并促进炎症消退。在COPD小鼠模型中，IMAMs显示出显著的抗菌和抗炎效果，能够有效地消除肺部定植的细菌，减轻肺部炎症，改善肺功能，并且促进炎症的解决。这些发现表明，IMAMs可能为COPD的管理提供了一种新的治疗策略，有望改变当前COPD治疗的范式。

原文链接：

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abd7904