J Periodontol：用于评估牙周多微生物生物膜抗菌效果的体外动态生物反应器模型

牙周炎是一种生物膜介导的破坏性炎症，导致牙齿支持组织的丧失。抗菌治疗可作为机械清创的辅助手段，旨在改善临床和微生物预后。抗菌剂对生物膜的作用已经使用各种体外模型进行了研究，其中大多数是静态平台，例如微量滴度板的孔。静态模型价格低廉，相对容易建立和操作，并提供高通量数据。然而，它们的缺点包括沉淀，营养物质供应有限，以及可能改变细菌生长的废物积累，特别是在多微生物生物膜中。生物膜生长在钛/羟基磷灰石圆盘上，结合在腭矫形器表面，提供了在原位条件下研究生物膜的优势。唾液的存在以及相关的温度和pH值变化使得原位生物膜模型具有临床意义。

然而，缺乏对几个实验变量的控制，包括患者可能不遵守规定的佩戴时间，可能被认为是缺点。另一方面，动态模型提供了营养物质的持续供应、流出介质的去除、控制介质流速和系统内的剪切力，从而模拟了口腔中的情况。随后，可以控制抗菌药物的输注速度，这是静态模型无法实现的。

美国疾病控制与预防中心(CDC)生物反应器是一种在动态和高剪切条件下培养生物膜和评估生物膜抗菌活性的成熟模型。CDC模型允许“实时”药代动力学和药效学响应，通过输入和输出端口输注介质/药物和收集流出介质。已经有许多尝试使用CDC生物膜反应器模型来评估对金黄色葡萄球菌和肠球菌衍生生物膜的抗菌效果。虽然个别种类的细菌与口腔疾病（如龋齿和牙周炎）的发病机制有关，但这些疾病与多微生物生物膜有关。因此，通过在实验室模型中创建口腔菌群的一个子集（微生物群落）来研究多微生物生物膜在临床上更为适用。阿莫西林(单独使用或更常与甲硝唑联合使用)由于具有广泛的抗菌活性，已被用作治疗牙周炎的非手术牙周清创术的辅助手段。阿莫西林的活性已经在静态时间杀伤模型生长的生物膜上进行了研究，显示出破坏生物膜基质和增加抗菌敏感性的功效。

然而，这些静态的时间杀伤研究本质上受到临床适用性和适当的抗菌药物分布、代谢和消除的限制。此外，缺乏评估阿莫西林对口服微药的影响的研究，其中药物已在高剪切条件下的动态介质流中注入生物反应器内。

因此，本研究旨在验证动态生物反应器模型，以评估临床相关阿莫西林剂量[龈沟液（GCF）中记录的浓度]对龈下菌斑衍生的多种微生物微生物的抗菌效果。本研究假设，基于抗生素的药代动力学，使用动态生物反应器输注临床相关剂量的抗生素（阿莫西林），将作为一种新的临床相关模型来评估其对微观多微生物生物膜的抗菌作用。

本研究的研究设计。(A)生物膜发育:在CDC生物反应器中，从汇集的龈下牙菌斑中培养生物膜。用光学显微镜、共聚焦显微镜、扫描电镜观察培养的生物膜，并用结晶紫染色。

(B)模拟阶段:随后，在实验反应器中每天输注阿莫西林14.5 μg/mL 3次，连续5天，相当于500 mg阿莫西林的GCF浓度。(C)通过共聚焦成像、扫描电镜和定量聚合酶链反应评估生物膜。

方法:在对照生物膜反应器和实验动态生物膜反应器中培养龈下菌斑生物膜108小时。随后将阿莫西林输注到实验反应器中，模拟500 mg标准每日三次给药方案5天内的药代动力学特征，并通过活/死染色、扫描电镜和定量聚合酶链反应评估生物膜。

结果:口腔微生物生物膜建立后，共聚焦成像分析显示，与对照生物膜相比，阿莫西林处理生物膜在8小时(p=0.0095)、48小时(p = 0.0070)、96小时(p = 0.0140)和120小时(p < 0.0001)时的死亡细菌数量显著增加。然而，活菌在所有时间点都停留在生物膜的中心。经阿莫西林处理的生物膜在96小时和120小时的时间点上，观察到直弯曲杆菌、连翘单宁菌、放线菌聚合杆菌和厌氧菌胃链球菌的显著减少/消除。

在模拟阶段的0、4、8、24、48、72、96和120小时，在XYZ平面上重建对照和阿莫西林处理的生物膜的三维共聚焦图像。对照生物膜的大部分在所有时间点都保留了绿色荧光(SYTO 9)，表明活的细菌细胞。在经阿莫西林处理的生物膜中，死菌散布在活菌中。在48、72和96小时，共聚焦图像显示的主要是死细菌，而不是活细菌。在120小时时，观察到更多的绿色斑块，可能表明生物膜内活细菌的复活。

对照生物膜的内(A)和外(B)片显示绿色荧光(活菌)，表明有活菌。相反，在阿莫西林处理的生物膜中，(C)内切片是绿色和红色荧光的组合(活细菌和死细菌)，而(D)外切片有更多的红色荧光(死细菌)。(E)对照和经阿莫西林处理的生物膜中死亡细菌的百分比。在8、48、96和120小时观察到显著差异。(F)与对照生物膜相比，阿莫西林处理生物膜的生物膜厚度在大多数时间点都较低，在24和48小时时显著降低。(G)对照和经阿莫西林处理的生物膜的生物量。8小时时观察到显著差异，其他时间点的生物量相当。(H)表示任意单位的生物膜粗糙度。在8、24、48和72小时，阿莫西林处理的生物膜粗糙度增加。

口腔微生物生物膜的扫描电镜图像。在对照和阿莫西林处理的生物膜中，模拟阶段的开始(培养5天后)都表示为0小时。细胞外基质中包裹着丰富的菌落，有不同种类的细菌(球菌和杆菌)。在阿莫西林处理的生物膜中，在4、8和24小时，细菌菌落相互分离(红色箭头突出了阿莫西林处理的生物膜在4和8小时分离的细菌菌落)。与对照生物膜相比，经阿莫西林处理的生物膜细菌菌落稀疏，细菌大小减小。

牙周细菌种类(牙龈假单胞菌、牙齿假单胞菌、连翘假单胞菌、中间假单胞菌、具核假单胞菌、直直假单胞菌、E

在模拟阶段的0、4、8、24、48、72、96和120小时，在对照和阿莫西林处理的生物膜中，腐蚀菌、放线菌、a和P.厌氧菌。*经阿莫西林处理的生物膜中#基因未检出，差异有统计学意义

结论:口服微生物生物膜体外动态模型可有效模拟阿莫西林临床相关剂量药代动力学模拟的抗菌效果。

文献来源：

Ramachandra SS,  Sime FB,  Naicker S,An in vitro dynamic bioreactor model for evaluating antimicrobial effectiveness on periodontal polymicrobial biofilms: a proof-of-concept study.J Periodontol 2023 Sep 19;