全面总结，肝癌10大标志物联合检测的对比评估

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）是一种常见的恶性肿瘤，在全球其发生率位于所有恶性肿瘤中第5位，在中国是第4位，死亡率在全球和中国都占所有恶性肿瘤中的第3位。在中国，平均每67秒就有一个人被诊断肝癌，而与此同时，平均每74秒就会有一个人死于肝癌。全球每年有新发肝细胞癌78.2万例，死亡74.5万例，中国2014年肝癌新发病例数约36.48万人，因肝癌死亡约31.88万人，肝癌发生率占全球的一半多。

从全球和中国来看，肝细胞癌的发病率与死亡率很接近，说明肝细胞癌的早期诊断率差因而治疗效果很差。肝癌确诊后5年生存率很低，仅为10%[1]。根据国家癌症中心发布的我国肝癌发病死亡流行现况、趋势及2030年预测分析结果，2030年和2014年相比，预测肝癌死亡人数将减少约11.95%，其中因为危险因素变化所致的肝癌死亡减少了60.99%，但人口老龄化却增加了44.05%的肝癌死亡，而人口总数的增长和发病一样将会增加约5%的死亡。

要提高肝细胞癌的治疗效果即5年生存率，首先得提高其早期诊断率即检测能力，检测能力也就是检测的灵敏度。

全球和中国的肝癌流行病学简况

全球肝癌发生率按高到低排行的前10个国家是蒙古、埃及、冈比亚、越南、老挝、柬埔寨、几内亚、泰国、中国和韩国。虽然中国排在肝癌高发国家的第9位，但是中国的人口数量大，乙肝病毒携带和慢乙肝患者数量多，因此肝癌的总患病例数也大，占全球总肝癌例数的一半以上。据统计，校正了年龄因素后，中国每10万人中，肝癌有18个[2]。肝癌的发生除与乙肝病毒相关外，还与饮食生活习惯如食用发霉的花生、玉米、豆类，酗酒、抽烟等有关。80%的肝癌患者有慢性肝炎病史。

通常来说，肝癌有三个阶段：乙肝→肝硬化→肝癌。在中国，超过80%的肝癌患者有慢性乙肝/丙肝病毒感染史。

肝癌的高危人群主要有：

1、乙型肝炎病毒和/或丙型肝炎病毒感染、长期酗酒（酒精性肝病）、非酒精性脂肪肝炎。

2、食用黄曲霉素污染的食物、多种原因引起的肝硬化以及有肝癌家族史的人群。

3、年龄40岁以上的男性风险较大。临床统计数据显示男性肝癌发病率远高于女性，在肝癌高发区男女发病率之比为(3-4)：1，在低发区为(1-2)：1。肝脏是人体最敏感亦是最脆弱的器官，劳累、酗酒、血糖过高等都会伤害肝脏，进而转为慢性肝损伤、肝炎，最后发展成为肝癌。

此外，工作紧张、精神压力过大，易导致人体免疫力低下，会促进癌细胞生长。近年的研究提示糖尿病、肥胖和吸烟等也是肝癌的危险因素[1]。

根据文献报道的临床上可用的肝癌标志物

目前临床上可用的检查手段包括肿瘤标志物的灵敏度都达不到要求。以下简要介绍一些目前可用的肝癌标志物：

甲胎蛋白（alpha-fetoprotein， AFP）

根据国家卫生健康委印发原发性肝癌诊疗规范（2019年版）的规定，当前临床上用于评估肝细胞癌风险的最有效手段是血清AFP联合超声检查，每6-12个月一次。血清AFP水平高于400ng/mL被认为有诊断价值，然而临床上只有少数肝细胞癌患者的血清AFP值高于这个值，约30%-35%的肝细胞癌患者血清AFP不升高，甚至大肿块的肝癌其血清AFP仍然正常。有的患者在肝细胞癌早期AFP升高，但到后来其水平反而下降甚至回复正常水平。

在特异性方面，AFP在急慢性病毒性肝炎、肝硬化、妊娠和畸胎瘤等也可升高。即使每三个月进行一次超声肝脏检查也无法查出早期肝细胞癌，因为超声检查的局限是缺乏前后数据比对回忆功能。研究发现，血清AFP水平与肝细胞癌的进展、预后并不呈平行关系，人种之间也会有差别。在一些病例，血清AFP根本就不升高[3]。

甲胎蛋白异质体-L3（AFP-L3）

根据其与凝集素Lens culinaris agglutinin（LCA） 的反应性不同，AFP有三种糖基化分型：AFP-L1、AFP-L2和AFP-L3。AFP-L3常用于孕妇的三联检检查和慢性肝脏疾病患者的肝癌筛查，被认为与患者的临床病理特征和差的预后关系更密切。AFP-L3与LCA结合很强，而AFP-L1则不同，它与非癌的肝脏炎症相关。AFP-L3在肝癌时升高，在北美，AFP-L3百分值（percentile）被作为肝癌标志物[3]。

异常凝血酶原（des-gammacarboxyprothrombin， DCP）

维生素K缺乏时诱导的蛋白质或拮抗剂II（protein induced by vitamin K absence or antagonist II ， PIVKA-II），由恶变的肝细胞（肝癌细胞）产生，属获得性维生素K依赖的羧化酶系统翻译后缺陷产物。虽然某些肿瘤患者给予维生素K后可短暂抑制DCP的产生，但DCP的产生与维生素K的缺乏无关。

用ELISA检测时，DCP水平超过0.1 AU/mL (100 ng/mL)时就高度怀疑肝细胞癌或肝癌治疗后复发，DCP恢复正常与肝细胞癌切除彻底有很好的关联性，是肿瘤活性的一个优秀标志物。AFP与DCP联合检测能提高肝细胞癌检测的灵敏度。DCP水平与肿瘤大小的关系仍未明了，有报道认为血清DCP水平与巨大肝细胞癌有关，然而小于3CM的肝细胞癌与DCP水平关联性不佳[3]。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（glypican-3， GPC3）

是一种膜定位的肝素硫酸蛋白聚糖。研究发现，GPC3与生长因子相互作用而调节后者的活性。肝细胞癌组织中GPC3 mRNA的表达显着升高。肝细胞癌患者血清中的GPC3蛋白水平和mRNA水平都比健康成人和肝良性肿瘤者高。

40–53%的肝细胞癌患者中可检测到GPC3，33%的血清AFP和DCP（Des-gammacarboxyprothrombin， DCP）都阴性的肝细胞癌患者可检测到GPC3。

临床观察发现，可溶性GPC3（soluble GPC3， sGPC3），即GPC3被蛋白水解酶切掉的N末端部分。在分化好或中等分化的肝细胞癌中，GPC3的检测比AFP敏感，如果GPC3与AFP同时检测可使检测灵敏度从50%提高到72%。GPC3阳性的肝细胞癌患者预后差[3]。

表1：文献报道的血清标志物对肝细胞癌的诊断效能

一项涉及207例肝细胞癌患者的横断面的病例对照研究（cross sectional case control study）结果发现，在鉴别肝细胞癌与良性肝脏疾病方面，DCP的灵敏度和特异性都比AFP高。该研究包含四组病例：健康人对照组、非肝硬化性慢性肝炎组、肝硬化代偿期组、病理组织学诊断为肝细胞癌组。这4组病例中，DCP和AFP水平随着疾病的严重性进展而升高（从正常到肝细胞癌），但DCP值在各组中的重叠性（交叉性）比AFP少，说明DCP的特异性更好，诊断价值更明确。

该研究的结论是：DCP值达125mAU/mL时对良性肝脏疾病和肝细胞癌的鉴别诊断的灵敏度和特异性达最佳状态。表1为AFP、AFP-L3、DCP以及它们的联合检测的灵敏度和特异性比较[3]。

在一项以参数进行网上计算的肝癌预警模型评估中，PIVKA-II和AFP显示更好的诊断灵敏度和特异性，而AFP-L3和AFU就不如前两者。PIVKA-II与AFP联合检测在鉴别由乙肝病毒引起的原发性肝癌（HBV-HCC）、慢性乙型肝炎（CHB）或慢性乙型肝炎性肝硬变（HBV-LC）时展示更好的诊断准确性，比单独的AFP或PIVKA-II的效能好（训练组的灵敏度为88.3%，特异性为85.1%，验证组的灵敏度为87.8%，特异性为81.0%）。包含AFP、PIVKA-II、年龄、性别的Nomogram对HBV-HCC的预测有良好效能[4]。

γ-谷氨酰转肽酶（gamma-glutamyl transferase， GGT）

血清GGT在正常成年人主要是由肝Kupffer细胞和胆管的内皮细胞分泌，肝细胞癌组织中GGT的活性升高。总GGT可分为13个同功酶，其中一些仅在肝细胞癌患者血清中检测到。GGTII同功酶在巨大肝细胞癌中的检测灵敏度可达74.0%，而在小肝细胞癌中的检测灵敏度只有43.8%。GGTII与DCP、AFP联合检测可显着提高灵敏度[3]。

血清α-1岩藻糖苷酶（serum alpha-1-fucosidase， AFU）

AFU是一种溶酶体酶，广泛存在于所有哺乳动物细胞、血液和体液中，其功能是水解岩藻醣连接糖蛋白与糖脂的糖苷键。肝细胞癌患者血清中的AFU活性升高（1418.62 ± 575.76 nmol/mL/h），而健康成年人为504.18 ± 121.88 nmol/mL/h，肝硬化患者为831.25 ± 261.13 nmol/mL/h，慢性肝炎者为717.71 ± 205.86 nmol/mL/h。在cut-off值为870 nmol/mL/h时，AFU的灵敏度为81.7%，特异性为70.7%。AFU与AFP联合检测被认为对肝细胞癌早期诊断有价值，可作为AFP诊断效能有价值的补充。

在肝硬化的患者中，AFU活性超过700 nmol/mL/h时，82%的患者提示几年内会发展为肝细胞癌。有85%的肝细胞癌患者其AFU活性升高比超声检测得到肝细胞癌要早6个月[3]。另一项对512例肝癌的研究发现，在cut-off值设为24 U/L 时，AFU对肝癌检测的灵敏度为56.1%，特异性为69.2%。而在cut-off值设为20 ng/mL时，AFP对肝癌检测的灵敏度为58.2%，特异性为85.2%。结论是AFU的诊断效能比AFP差，可作为一个补充而已[5]。

人羰基还原酶 2（human carbonyl reductase 2）

该酶在人肝和肾中表达。在肝脏，它对活性的α-二碳基化合物和肝细胞癌产生的活性氧的去毒性作用很重要。研究发现，人羰基还原酶 2水平与肝细胞癌的病理级别呈反相关关系，即肝癌细胞的病理级别越高则人羰基还原酶 2的水平越低[3]。

高尔基磷酸蛋白2（golgi phosphoprotein 2， GOLPH2）

是一种高尔基体相关蛋白，据报道其检测肝细胞癌的灵敏度比AFP高，71%的肝细胞癌患者癌组织中出现GOLPH2A表达升高，85%的胆管癌患者表达升高。血清GOLPH2蛋白可用ELISA法检测到。在丙型肝炎患者中，通过动态的ELISA法检测血清GOLPH2蛋白可作为肝细胞癌发生监测的一个有效标志物[3]。

肿瘤特异性生长因子（tumor-specific growth factor， TSGF）

恶性肿瘤在生长过程中释放TSGF到血液中，因此血清TSGF可提示肿瘤的存在。TSGF可作为肝细胞癌的诊断标志物，在cut-off值为62U/mL时，它的灵敏度可达82%， 如果与其它肿瘤标志物同时检测，其准确性可更高。TSGF（cut-off值为65U/mL）、AFP（cut-off值为25 ng/mL）、铁蛋白（cut-off值为240 ng/mL）同时检测时，据报道其灵敏度可达98.4%，特异性可达99%[3]。

碱性纤维母细胞生长因子（Basic Fibroblast Growth Factor， bFGF）

是一种可溶性肝素结合多肽，是内皮细胞的一种强的丝裂原物质。血清中的bFGF高于中位水平（>10.8 pg/mL）预测无疾病生存率下降。针对bFGF靶向治疗对肝细胞癌有令人鼓舞的效果[3]。

肝癌早期诊断的临床挑战

肝细胞癌早期诊断的关键指标是发现肿瘤直径小于2CM的肝癌。然而，目前采用的超声、CT、磁共振（MRI）以及血清可溶性肝细胞癌标志物的诊断效能无法检测2CM肝癌。不仅如此，现用的血清肝癌标志物甚至大肝癌仍有30%左右检测不出而造成漏检。被列入肝癌诊断指标的AFP其诊断效能差，灵敏度和特异性都低，对大肝癌的检测能力有限，更无法检测出小肝癌。表1中列出的各种血清标志物，无论是单独检测或联合检测，其敏感性都达不到90%。

需要解决的临床问题

目前无法检测出小于2CM的肝细胞癌，也就是无法提高肝癌患者的长期生存率。能够诊断2CM以下的小肝癌然后手术切除是治疗肝细胞癌的有效措施，可使肝癌患者长期存活。通过肝脏超声、CT、MRI影像学普查肝癌不切实际，费用高而效果不佳，手续繁琐，因为影像学诊断也经常漏诊，查不出小肝癌，而且超声检查受肥胖体质、肝硬化、操作者经验影响，即使有经验的操作者仍然需要患者前后影像学结果比对，因此大规模普查可行性很低。

所采取的措施

国内外已有针对肝癌早期诊断难题而开发出一个根据病人年龄和性别，结合AFP、DCP和AFP-L3检验结果而经数学运算得出的一个数学模型来诊断肝癌。然而各种模型虽然有一定的诊断价值，但离临床需求还存在这样那样的问题，况且有的模型不太适合中国人群的特点。

当前需要考虑的工作和探索

提高肝癌早期（小肝癌）的诊断率的理想方法当然是发现一种新的灵敏度高，单独检测或与另一种标志物联合检测而达到90%以上的灵敏度、特异性又好（达到85%以上或联检后特异性仍保持85%以上）的标志物，即100个肝癌中只有10个漏检，而提示肝癌的病例最终只有15个不是肝癌。然而，探索这么一种高效的肝癌标志物的难度是相当高的。从目前来看，仍然没有找到一个生物标志物通过与AFP或DCP或AFP-L3或AFU联合检测后能把肝癌检测灵敏度提高到90%以上而特异性又不降低的诊断效能。

EGF和TSGF是广谱性生物标志物，虽然灵敏度高，但它们的缺点是特异性很差，很多炎症和良性肿瘤也升高，因而会使临床鉴别/排除诊断增加负担，诊疗费用也增加，因此临床应用价值很有限。一段时间以来，人们在试图通过结合患者临床指标和肝癌标志物检测结果进行数学模型运算而达到提高肝癌预测能力，即在现有已报道或使用的肝癌标志物的基础上进行有效的联合检测，并建立肿瘤预测数学模型（nomogram）来提高检测灵敏度，目标是能检测出或预警2CM的肝癌，然后再进一步用超声、CT或MRI或进一步病理检查以确诊或排除肝癌，其诊断效能比单独的超声、CT、MRI都要优越。

附注：日本肝脏病协会2019年发布了“肝癌临床实践指南：2017年日本肝脏病协会第4版肝癌诊疗指南的更新”。

更新指出，当病人存在以下三项中的任何一项时被认为属肝癌高危人群：肝硬化、慢性乙肝或慢性丙肝。在高危病人中，那些有乙肝或丙肝引起的肝硬化被认为属极高危人群。肝癌根治性治疗（手术切除）后每年有≥10%的复发率，5年复发率达70–80%。

因此，对于极高危病人组的治疗后监测也应该得到足够严格进行。超声检查是筛查手段的第一选择，与AFP、DCP、AFP-L3同时进行。对于高危人群，上述筛查手段每6个月进行一次，而对于极高危人群则每3个月进行一次。对于极高危人群或不易进行肝脏超声的病人，如肝萎缩、重度肥胖、肝术后形态变异，这种定期筛查可与动态CT或动态MRI同时进行。当超声检查发现新的结节时，以动态CT/MRI作为鉴别诊断。

甚至是超声未检测到肿瘤，以下病例也应考虑采用动态CT/MRI扫描：持续性AFP升高、或AFP ≥200 ng/mL、或DCP ≥40 mAU/mL、或AFP-L3 ≥15%。第4版中重新采用前一版的有关CT增强扫描的措施（略）。在小肝癌（≥1.5CM甚至1CM）时，各种CT、MRI、超声的增强扫描措施，以及血管造影扫描、肝活检都可考虑使用（略）。其它更小的肝肿物也遵循每3个月超声检查一次的原则。动态CT/MRI扫描检查仅在超声发现肿物增大、或肿瘤标志物升高时采用[7]。

【参考文献】

1. Zhang BH， Yang BH， Tang ZY. Randomized Controlled Trial of Screening for Hepatocellular Carcinoma. J Cancer Res Clin Oncol 2004；130：417-22.

2. WHO：http：//gco.iarc.fr

3. Behne T， Copur MS. Biomarkers for Hepatocellular Carcinoma. Int J Hepatol. 2012；2012：859076. doi： 10.1155/2012/859076. Epub 2012 May 10.

4. Yang T， Xing H， Wang G， Wang N， Liu M， Yan C， Li H， Wei L， Li S， Fan Z， Shi M， Chen W， Cai S， Pawlik TM， Soh A， Beshiri A， Lau WY， Wu M， Zheng Y， Shen F. A Novel Online Calculator Based on Serum Biomarkers to Detect Hepatocellular Carcinoma Among Patients With Hepatitis B. Clin Chem. 2019；65：1543-53.

5. Xing H， Qiu H， Ding X， Han J， Li Z， Wu H， Yan C， Li H， Han R， Zhang H， Li C， Wang M， Wu M， Shen F， Zheng Y， Yang T. Clinical Performance of α-L-fucosidase for Early Detection of Hepatocellular Carcinoma. Biomark Med. 2019；13：545-55.

6. 中国肝细胞癌诊断标准（指南）：中国临床肿瘤学会（CSCO）原发性肝癌诊疗指南，2018.V1

7. Kokudo N， Takemura N， Hasegawa K， Takayama T， Kubo S， Shimada M， Nagano H， Hatano E， Izumi N， Kaneko S， Kudo M， Iijima H， Genda T， Tateishi R， Torimura T， Igaki H， Kobayashi S， Sakurai H， Murakami T， Watadani T， Matsuyama Y. Clinical practice guidelines for hepatocellular carcinoma： The Japan Society of Hepatology 2017 (4th JSH-HCC guidelines) 2019 update. Hepatol Res 2019；49：1109-1113.