Mol Psychiatry： 结合扩展和 STED 显微镜揭示了 ASD 相关 SHANK3 缺陷的大脑区域突触后纳米结构指纹的改变

近年超分辨显微技术如STED、SIM、STORM等实现了光学上的突破，实现了更细致地研究细胞结构。但是这些技术应用在厚组织时面临困难。与之不同，展张显微镜通过将样本嵌入可扩大胶体实现物理放大，突破了光学分辨率限制，对神经系统组织研究极为适用，包括神经突触。

突触的纳米级组织极为复杂，各种蛋白精细排列形成不同亚区，在神经传导和可塑性中起关键作用。这对理解神经发育障碍如自闭症至关重要。SHANK3是突触后密度浓集的重要结构蛋白，SHANK3缺陷与这类障碍相关。

本研究旨在优化展张显微镜在小鼠和人脑组织样品中的应用，并兼容STED显微镜，观察WT和SHANK3基因敲除小鼠不同脑区突触的纳米组织变化，为解明神经精神障碍的突触失调机制提供机制理解。

研究方法上，作者采用Sh3缺陷小鼠与野生型小鼠模型，选择6-18周龄同胞小鼠共计6只，每组3只进行对比研究。利用常规固定和切片方法制备小鼠大脑标本，然后采用扩大显微镜技术对标本进行处理，包括固化与扩大，并对鼠大脑细胞进行显色。

接着，采用多种抗体对扩大标本进行多重免疫荧光标记，以观察不同分子在细胞和突触中的定位特征。利用共聚焦显微镜和STED显微镜对标本进行成像 acquisition。然后对获得的图像进行滤波、分割等预处理，提取各种结构参数，如体积、表面积等。

在此基础上，采用PCA与聚类等多元统计方法对结构参数进行分类分组，同时采用MANOVA等多重分析模型对不同组间进行比较检验。此外，还采用近邻距离分析评价细胞和分子在空间中的排列规律。

图1：ExM和ExM-STED保留细胞和突触超微结构

研究结果上，研究根据突触板标记物DLG4的形状进行聚类分析，发现不同大脑区域突触形状存在显著差异，这为不同区域的突触“指纹”提供了证据。

图2：通过ExM-STED可视化的突触蛋白定位

为验证ExM-STED技术是否能检测出基因故障小鼠突触结构的变化，研究人员选取了SHANK3缺失小鼠作为模型。与野生型小鼠相比，SHANK3缺失小鼠的突触形状明显变小和不成熟。

图3：形态特征定义了大脑区域和基因型依赖性突触指纹图谱

同时，ExM-STED显示突触细胞内存在分子集群的模式。研究发现SHANK3缺失会影响这些集群在大小、分布和组织模式等方面的变化。其中突触板内同体蛋白HOMER1集群尤其明显变小。

图4：ExM-STED能够检测SHANK3-KO小鼠的异常突触下组织

除个体分子水平的变化外，研究还发现突触之间相关分子如HOMER1-DLG4的连接强度减弱。这表明SHANK3缺失会干扰突触分子之间的空间组织。

图5：跨基因型和大脑区域的突触下组织的视觉比较

总之，本研究利用创新技术对突触结构进行前所未有的揭示，为精神病如自闭症的病理机制提供了新见解。

文献出处：

Delling， J.P.， Bauer， H.F.， Gerlach-Arbeiter， S. et al. Combined expansion and STED microscopy reveals altered fingerprints of postsynaptic nanostructure across brain regions in ASD-related SHANK3-deficiency. Mol Psychiatry (2024). https://doi.org/10.1038/s41380-024-02559-9