兰州大学范增杰AFM：3D打印仿生软骨支架在原位诱导骨软骨缺陷修复中的应用！

关节软骨组织的3D打印面临复制其复杂结构、体外耗时的干细胞培养以及缺乏针对骨软骨缺陷（OC）的稳健原位再生方法等挑战。为了应对这些挑战，兰州大学范增杰提出了一种创新方法，即使用预设计的生物墨水模块单元进行一步法打印和即时植入，绕过了事先体外干细胞培养的需要。打印出的支架不仅准确再现了关节软骨组织的三层结构和材料梯度，而且通过羟基磷灰石纳米纤维的增强以及与水凝胶建立化学键，达到了令人印象深刻的压缩强度（6.3 MPa）。此外，该支架在其底部和顶部层通过化学交联的寡核苷酸和装载有基质细胞衍生因子-1α（SDF-1α）的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米球，分别整合了干细胞捕获和归巢层。这种设计能够通过寡核苷酸的相互作用在体内特异性捕获骨髓间充质干细胞（BMSCs），然后通过SDF-1α浓度梯度的趋化作用使其归巢至透明软骨层。在支架的微环境中，这些BMSCs分化为每层的不同细胞，有效促进了家兔OC缺陷的修复。该研究以题为“Rapid Customization of Biomimetic Cartilage Scaffold with Stem Cell Capturing and Homing Capabilities for In Situ Inductive Regeneration of Osteochondral Defects”的论文发表在《Advanced Functional Materials》上。

图1展示了预先设计的生物墨水模块单元的组成、制造过程以及原位诱导骨软骨缺陷（OC缺陷）再生的示意图。通过这种设计，研究者们能够利用3D打印技术一步打印出模仿自然关节软骨组织三层结构的定制化生物支架，该支架具备即刻植入能力，无需体外BMSCs的共培养。这一方法有效地模拟了关节软骨的三重结构，并通过化学交联和纳米纤维增强，实现了支架的优异机械性能和生物功能性，为软骨组织工程和原位再生策略提供了重要的技术进步。

图1. 预先设计的生物墨水模块化单元的组成和制造工艺以及OC缺陷的原位感应再生过程的示意图

【功能仿生软骨支架的表征】

图2通过X射线衍射（XRD）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析，确认了羟基磷灰石纳米纤维（HANFs）与水凝胶的成功复合。扫描电子显微镜（SEM）图像展示了GS69支架的显著三层结构，包括顶层（I区）、中间层（II区）和底层（III区），并且通过荧光显微镜确认了HANFs的梯度结构。此外，通过压缩强度和拉伸应力测试，证实了支架具有出色的机械性能，特别是梯度支架展现出与人类天然软骨相似的压缩强度（约6.3 MPa），这为支架在体内保持形状和提供所需力量以保护和维护植入支架提供了保证。这些结果表明，通过合理设计的生物墨水模块单元，可以制造出具有良好细胞相容性和机械强度的功能性软骨支架，为原位诱导骨软骨缺陷的再生提供了一个有效的平台。

图2.物理化学、形态学和力学表征

【体外和体内干细胞募集】

图3展示了支架对骨髓间充质干细胞（BMSCs）的招募性能。通过晶体紫染色和免疫荧光染色评估了支架对BMSCs的体外招募效果和在体归巢能力。结果显示，修饰有HM69寡核苷酸和装载有SDF-1α的PLGA纳米颗粒的支架在体外实验中，与其他支架相比，在24小时培养后显示出更高的BMSCs招募能力。在体内实验中，通过免疫荧光染色观察到GS69组在第4天相比于第1天招募了更多的BMSCs，促进了它们向软骨缺损区域的迁移。这些结果表明，通过HM69和SDF-1α的功能化修饰，支架能有效地在体内外招募和促进BMSCs的归巢，从而为软骨缺损的原位诱导再生提供了有效的细胞来源。

图3.体外和体内干细胞募集

【打印支架上的细胞相容性、细胞粘附和增殖】

图4通过活死细胞染色和Phalloidin/Hoechst染色，结果显示支架上培养的BMSCs在1、3、5和7天的存活率与对照组相比没有显著差异，几乎所有细胞都显示出活细胞的绿色荧光，而不是死细胞的红色荧光，表明所有支架都具有良好的生物相容性。此外，通过EdU增殖实验，发现GS69组在24小时培养后细胞增殖的数量与阴性对照组没有显著差异，说明该组支架对细胞增殖没有负面影响。这些结果证实了打印支架在体内使用时对细胞的安全性和支持细胞增殖的能力。

图4.打印支架上的细胞相容性、细胞粘附和增殖

【打印支架的体内修复效果】

图5通过术后6周和12周的观察，GS69组（功能化梯度支架）在软骨缺损区域形成了完整且平滑的软组织，相比之下，其他组（包括对照组、H、HS、GS、G69和HS69）只显示出部分软组织修复。微CT重建的2D和3D图像进一步证实了GS69组在6周时有明显的新骨生长，而其他组的修复效果不明显。12周时，GS69组的修复效果最佳，缺损区域几乎被新形成的骨完全覆盖，并且新软骨组织与周围组织良好整合。国际软骨修复协会（ICRS）宏观评分也显示，GS69组的修复效果显著优于对照组，其修复程度接近正常软骨。定量评估新形成的骨组织体积也证实了GS69组的修复效果。这些结果表明，GS69支架对OC缺陷具有显著的修复效果，能够促进软骨和骨组织的原位诱导再生。

图5.打印支架的体内修复效果

【组织学分析】

图6提供了对修复软骨的组织学评估，包括H&E染色、Safranin O/Fast Green染色和Alcian Blue (AB)染色的组织形态学分析。在6周时，对照组显示出有限的纤维和不成熟组织修复，而GS69组的软骨缺损下层被非降解支架填充。到了12周，GS69组的软骨成功再生，组织形态与正常透明软骨相似，并且新生成的软骨与周围软骨良好整合，软骨下骨也生长良好。组织学评估通过修改的O'Driscoll组织学评分系统进行量化，结果显示GS69组在6周和12周时的得分最高，与其他支架相比，在结构完整性、细胞形态、基质染色和软骨外观方面有显著优势。这些结果进一步证实了GS69支架在促进软骨再生方面的有效性。此外，对植入支架对内脏器官潜在毒性的评估显示，心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏样本在12周时未显示出由支架引起的损伤迹象。免疫组化染色分析也表明，GS69组在6周时未显示出IL-1β和TNF-α的炎症或感染迹象，而到了12周，空白对照组和GS69组的IL-1β和TNF-α表达都很少。这些发现表明，GS69支架不仅在促进软骨缺损的修复方面表现出色，而且对周围组织和内脏器官没有不良影响。

图6.组织学分析

【免疫荧光分析】

图7通过免疫荧光分析评估了打印支架在软骨修复中对骨髓间充质干细胞（BMSCs）向软骨细胞和成骨细胞分化的促进作用。在6周时，GS69组（功能化梯度支架）中ACAN（软骨素核心蛋白）和COL2A1（II型胶原蛋白α1链）的阳性细胞率显著高于其他组，而COL1（I型胶原蛋白）和RUNX2（与成骨分化相关的转录因子）的阳性细胞率接近含有羟基磷灰石纳米纤维（HANFs）的组。到了12周，GS69组中ACAN、COL2A1、COL1和RUNX2阳性细胞的百分比增加，细胞分布和形态规则，伴随着ACAN和II型胶原蛋白基质染色。此外，通过COL1和RUNX2的高表达验证了骨髓腔附近新骨的形成。这些结果表明，GS69支架提供的适宜微环境显著促进了BMSCs向软骨细胞和成骨细胞的分化，导致软骨和骨组织的成功的再生。此外，研究还表明，仅SDF-1α的释放对诱导BMSCs的软骨细胞分化没有显著效果，而支架的机械性能和微环境的协调是促进干细胞分化的主要原因。

图7.免疫荧光分析

【小结】

该研究通过3D打印技术制作的仿生软骨支架不仅能够精确复制关节软骨组织的三层结构和材料梯度，而且通过羟基磷灰石纳米纤维的增强和与水凝胶建立化学键，达到了令人印象深刻的压缩强度（6.3 MPa）。支架的复杂设计包括干细胞捕获层和定位层，为捕获和动员骨髓腔中的骨髓间充质干细胞（BMSCs）到损伤部位提供了一种独特而有效的方法。这种支架的生物模拟设计结合了材料和结构梯度模拟，为BMSCs分化成每层的不同细胞类型建立了理想的微环境。因此，这种方法允许定制受损的关节软骨组织，并通过3D打印技术高效生产支架。通过将多种功能整合到单个支架中，可以立即将其植入受损的软骨部位，避免了体外干细胞共培养的需要。因此，一步法3D打印的软骨支架，允许立即植入和原位诱导骨软骨再生，代表了传统治疗方法的重大进步，并在OC修复中显示出巨大的潜力。

原文链接：

https://doi.org/10.1002/adfm.202400608