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中国青年学者一作！《Science Immunology》：促进T细胞杀伤敏感，克服前列腺癌免疫治疗耐药性

2023-05-14 BioMed科技网络发表于上海

血液新前沿

前列腺癌免疫治疗耐药性新突破

前列腺癌的非炎症微环境是免疫治疗的一个障碍。癌细胞内在致癌信号背后的基因改变因其在塑造免疫景观中的作用而越来越受到重视。最近，美国圣母大学Lu Xin教授及其团队鉴定了Pygopus 2（PYGO2）是前列腺癌中1q21.3扩增子的驱动致癌基因，通过转移性前列腺腺癌的转基因小鼠模型，发现Pygo2缺失减缓了肿瘤进展，减少了转移，并延长了生存期。Pygo2缺失增强了细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）的激活和浸润，并使肿瘤细胞对T细胞的杀伤敏感。在机制上，Pygo2协调了一个p53/Sp1/Kit/Ido1信号网络，以培养一个对CTLs不利的微环境。Pygo2的基因或药理抑制增强了使用免疫检查点封锁（ICB）、过继细胞转移或抑制髓系源性抑制细胞的药物的免疫治疗的抗肿瘤疗效。在人前列腺癌样本中，Pygo2的表达与CD8+ T细胞的浸润呈负相关。对ICB临床数据的分析显示，高Pygo2水平与较差的预后相关。总之，本研究结果突出了一个改善使用Pygo2靶向治疗晚期前列腺癌的免疫治疗的潜在途径。相关研究成果以“Targeting the chromatin effector Pygo2 promotes cytotoxic T cell responses and overcomes immunotherapy resistance in prostate cancer”为题发表在免疫学顶级期刊《Science Immunology》上。

【Pygo2在GEM和同基因模型中促进PCa的进展和转移】

将携带Pygo2 loxP等位基因的小鼠与转移性PCa模型PB-Cre4+ PtenL/L Smad4L/L双敲除（pDKO）小鼠杂交，生成PB-Cre4+ PtenL/L Smad4L/L Pygo2L/L三敲除（pTKO）小鼠（图1A），并证实了他莫昔芬诱导的Pygo2表达缺失（图1F）。在pTKO小鼠中，前列腺特异性的Pygo2明显丢失（图1B）。通过MRI检测到，pTKO小鼠在出生后约10个月出现肿瘤生长减慢（图1C）。与pDKO小鼠相比，pTKO小鼠的中位生存期延长了10周（图1D）。免疫组化显示pTKO肿瘤中增殖低于pDKO肿瘤，且凋亡更强（图1E）。nTKOLuc小鼠比nDKOLuc小鼠存活了12.8周（中位存活期）（图1G），而nTKOLuc肿瘤进展较慢（图1H）。与nDKOLuc小鼠相比，nTKOLuc小鼠的引流淋巴结和肺的转移也减弱了（图1I）。为了便于机制研究，作者在小鼠PCa细胞系TS3132中敲除Pygo2（图1J）。Pygo2基因敲除减弱了皮下肿瘤的生长（图1K）。为了便于研究Pygo2在肿瘤免疫调节中的作用，从pDKO和pTKO肿瘤中建立了Pten/Smad4（PS）和Pten/ Smad4/Pygo2（PSP）细胞系（图1L）。当皮下注射到C57BL/6雄性体内时，PS肿瘤的生长速度明显快于PSP肿瘤（图1M）。这些新建立的GEM和同基因模型加强了Pygo2的PCa促进功能。

图1 Pygo2在GEM和同基因模型中促进PCa的进展和转移

【Pygo2抑制CTL的浸润，减弱CTL对PCa细胞的杀伤】

在pTKO肿瘤中，CD8+ T细胞显著增加(图2A)。通过IHC证实，与pDKO肿瘤相比，pTKO肿瘤中总T细胞和CD8+ T细胞亚群的浸润程度更高（图2B）。通过流式检测nDKOLuc和nTKOLuc肿瘤时，Pygo2缺陷肿瘤的CD8+ T细胞增加，CD4+ T细胞增加，CD4+ T细胞中Treg频率降低（图2C）。与自发性肿瘤一致，同基因PSP肿瘤包含更多的CD8+和CD4+ T细胞和更高的CD8+/调节性T（Treg）细胞比例，这种模式通过恢复PSP细胞中Pygo2的表达而逆转（图2D）。在PS和PSP细胞系中稳定表达鸡卵清蛋白（OVA），并将这些亚系与来自OT-I小鼠的OVA特异性T细胞受体（TCR）转基因CD8+ T细胞共培养，PSP-OVA细胞对OT-I-T细胞的杀伤作用比PS-OVA细胞更为敏感（图2E）。虽然敲除RM9中的Pygo2对裸鼠肿瘤生长有轻微影响（图2F），但它在C67BL/6小鼠中增加了T细胞浸润，显著减少了肿瘤形成(图2G)。使用抗CD8中和抗体在携带PS和PSP肿瘤的C57BL/6小鼠中清除CD8+ T细胞(图2H)。CTL消融对PS肿瘤的生长影响不大，但部分恢复了PSP肿瘤的生长（图2I、J）。综上，来自不同模型的数据表明，Pygo2在PCa细胞中的表达可以诱导细胞非自主活性，以限制效应T细胞的浸润和细胞毒性。

图2 Pygo2抑制CTL的浸润，减弱CTL对PCa细胞的杀伤

【Pygo2通过Kit上调促进PCa进展】

为了鉴定Pygo2调控的基因，使用pDKO和pTKO肿瘤及地衣芽孢杆菌衍生蛋白酶进行上皮细胞纯化和微阵列分析(图3A)。基因集富集分析（GSEA）显示，p53通路和上皮间充质转化（EMT）通路在pDKO肿瘤细胞富集，而免疫相关途径，如IFN-α反应，IFN-γ反应，IL-6，STAT3信号在pTKO肿瘤细胞富集（图3B）。在pTKO PCa细胞中下调的基因中，有多个被IPA定位为Kit下游基因（图3C）。使用分选的pDKO和pTKO PCa细胞验证了Pygo2缺失诱导的Kit下调（图3D）。在蛋白水平上，与pDKO肿瘤相比，pTKO肿瘤中的Kit和部分Kit下游信号蛋白也被减弱（图3E）。在PCa细胞系中，Pygo2敲除对Kit的下调也很明显（图3F）。IHC证实了pDKO肿瘤中Kit和Ido1的表达高于pTKO肿瘤（图3G）。C57BL/ 6小鼠中Kit shRNA的下调减缓了PS肿瘤的生长，但对PSP肿瘤的影响不大(图3I、J)。PSP中Kit的表达恢复了球形形成（图3K)和使体内致瘤性达到PS水平（图3L）。这些结果支持了Pygo2-Kit轴的因果关系。

图3 Pygo2通过Kit上调促进PCa进展

【Pygo2与p53协同上调Sp1/Kit轴】

使用IPA识别Kit上游可能的转录因子（图4A）。对具有IPA或Enrichr的pDKO和pTKO PCa细胞之间的DE基因进行TF富集分析，发现TP53是pDKO中最显著富集的TF之一(图4B)。Pygo2基因敲除在Pten/p53或Pten/Smad4/p53基因背景下，Pygo2基因的缺失并不影响生存期（图4C）。pDKO肿瘤中p53蛋白水平高于pTKO肿瘤（图4D）。使用TS3132和Pygo2敲除亚系进行的p53报告基因分析表明，Pygo2缺失抑制了nutlin-3、喜树碱（CPT）或阿霉素刺激的p53活性（图4E）。表明p53的活性的乙酰化和磷酸化，PS中nutlin-3比PSP更明显（图4F）。PYGO2的扩增与TP53的改变互增相互排斥（图4G）。仅在TP53-WT组中，PYGO2扩增与较差的无病生存率相关（图4H）。Pygo2与组蛋白H3K4me2/3的结合对Kit的调控至关重要，因为PSP细胞中Kit的表达可以被WT Pygo2的异位表达所挽救，而不是H3K4me2/3结合缺失的Pygo2突变体（Y326A和W351A）(图4I)。在Sp1的启动子区附近发现了一个Pygo2、p53和H3K4me3的共定位结合峰（图4J），并利用TS3132亚系进行CUT&RUN-qPCR验证（图4K）。在蛋白水平上，Sp1在pDKO肿瘤中的表达水平高于pTKO，这与pDKO肿瘤中较高的p53修饰和表达水平相一致（图4L）。通过CUT&RUN-qPCR检测证实了Sp1与Kit启动子区域的结合（图4M）。shRNA沉默Sp1仅下调了PS细胞中Kit的表达和球形形成，而对PSP细胞无影响(图4N、O)。以上结果表明在PCa细胞中建立了新通路，Pygo2参与p53与Sp1启动子结合以维持Sp1的表达，而Sp1随后促进Kit的转录和表达。

图4 Pygo2与p53协同上调Sp1/Kit轴

【Pygo2通过Kit-Ido1通路下调T细胞浸润】

PS中Kit的敲低使PS肿瘤中CD8+ T细胞的浸润增加到与PSP肿瘤相同的水平，而在PSP中稳定表达相同的Kit shRNA并没有改变CD8+ T细胞的浸润（图5A、B）。流式细胞术证实肿瘤细胞表面的Kit表达（图5C）。通过比较PS-OVA和PSP-OVA与它们各自的Kit敲除OT-I T细胞杀伤亚基因，发现Kit沉默使PS-OVA敏感，而PSP-OVA无效（图5D）。虽然Trp水平没有差异，但在pTKO肿瘤中，Kyn和Kyn/ Trp比值显著降低（图5E）。在PSOVA的裂解液和培养基中，Kyn/Trp的比率也比PSP-OVA细胞高得多（图5F）。Trp代谢物（Ido1产物）逆转了PSP-OVA细胞中对OT-I T细胞杀伤的敏感性（图5G）。为了在体内靶向Kit-Ido1轴，用伊马替尼或1-MT治疗携带PS或PSP同基因肿瘤的小鼠，观察到这两种抑制剂都抑制PS肿瘤的生长，但没有抑制PSP肿瘤的生长（图5H、I）。以上结果表明Kit-Ido1级联反应是Pygo2介导的PCa中CTL排斥的潜在机制。

图5 Pygo2通过Kit-Ido1通路下调T细胞浸润

【Pygo2主要通过scRNA-seq和功能分析调节肿瘤浸润性T细胞】

从1453个nDKOLuc细胞和2055个nTKOLuc细胞中获得了单细胞转录组，这些转录组聚集成14个细胞簇，包括11种免疫细胞类型(图6A、B)。CD8+和CD4+ T细胞在nTKOLuc肿瘤中更为丰富，而Treg和上皮癌细胞在nDKOLuc肿瘤中更为丰富（图6C）。使用基因集变异分析（GSVA）发现来自nTKOLuc的CD8+ T细胞富集于与T细胞活性相关的各种途径，如CD28家族、CTL途径、TCR通路、T细胞毒性途径和IL-2家族信号通路的共刺激（图6D）。来自nTKOLuc的CD8+ T细胞表达的所有检测的细胞因子（IFN-γ）和效应分子（如穿孔素和颗粒酶）的水平显著高于来自nDKOLuc的CD8+ T细胞（图6E）。流式细胞术对IFN-γ和TNF-α的细胞内细胞因子染色显示，nDKOLuc肿瘤中CD8+ T细胞中IFN-γ+和TNF-α+亚群的比例明显高于nDKOLuc肿瘤（图6F）。PS细胞（无OVA）比PSP细胞（无OVA）更能减弱细胞因子的产生（TNF-α、IFN-γ和IL-2）(图6G)。与RM9-sgScr-OVA肿瘤相比，RM9-sgPygo2-OVA肿瘤中CD8+ T细胞的频率更高，四聚体+CD8+T细胞的频率更高（图6H）。这些数据表明肿瘤细胞表达的Pygo2主要限制TME中的CTLs，但对树突状细胞或瘤外CD8+ T细胞的启动几乎没有影响。

图6 Pygo2主要通过scRNA-seq和功能分析调节肿瘤浸润性T细胞

【Pygo2的缺失和药理抑制增强了免疫治疗】

ICB和Pygo2联合敲除消除了所有RM9肿瘤（图7A、B）。与对照组相比，单剂量ACT更能减缓Pygo2敲除OVA肿瘤（图7C）。Pygo2敲除OVA肿瘤中CD8+ T细胞浸润比对照组OVA肿瘤高4倍（图7D）。尽管在减轻nTKOLuc肿瘤进展方面，SX-682不如Pygo2缺失强，但将Pygo2缺失和SX-682联合治疗导致最小的肿瘤（图7E）和最长的生存期（图7F）。在nDKOLuc和nTKOLuc肿瘤中，SX- 682减少了PMN-MDSCs，增加了CD8+ T细胞，并下调了CD4+ T细胞的Treg分数（图7G）。作者合成了JBC117及其类似物JBC117ana，它缺少一个羟基(图7H）。JBC117或JBC117ana降低了肿瘤生长和Kit和Ido1的表达，但在PSP肿瘤中没有降低（图7I-K），表明了抑制剂的靶标活性。在RM9模型中，ICB和JBC117表现出单药抗肿瘤活性，联合使用表现出更强的疗效（图7L）。ICB或JBC117增加了CD8+的浸润，而没有增加CD4+ T细胞浸润，JBC117增强了ICB降低肿瘤Treg的能力（图7M）。在PS模型中也观察到了ICB和JBC117的组合疗效（图7N）。尽管MyC-CaP CRPC肿瘤单独对ICB有耐药性，对JBC117部分敏感，但ICB和JBC117联合诱导了最高水平的肿瘤控制（图7O）。这些结果表明，Pygo2抑制是一种很有前途的方法，可以使晚期PCa（包括CRPC）对ICB治疗敏感。

图7 Pygo2的缺失和药理抑制增强了免疫治疗

【在ICB临床队列中，人PYGO2过表达与较低的CTL浸润
和较差的预后相关】

CTL特征是在PYGO2低表达的患者样本中富集（图8A）。对36个存档的人原发性PCa样本中的PYGO2和CD8进行了免疫荧光（IF）染色（图8B）。在A组中，PYGO2表达量较高的样本中CD8+ T细胞明显减少，而在B组中PYGO2表达量较高的肿瘤区域中CD8+ T细胞浸润也明显减少（图8C）。PYGO2high组的总生存率（OS）低于PYGO2low组（图8D）。PYGO2high肿瘤患者的OS和无进展生存期（PFS）均明显缩短（图8E）。

图8 在ICB临床队列中，人Pygo2过表达与较低的CTL浸润和较差的预后相关

【总结】

综上所述，本研究的一个重要贡献是靶向Pygo2的翻译意义。通过对Pygo2的基因消融，作者证明了当Pygo2共靶向时，三种免疫治疗方法（ICB、ACT和CXCR2抑制剂）在PCa小鼠模型中均得到增强。此外，作者合成了JBC117和JBC117ana作为Pygo2抑制剂的原型，并表明它们在很大程度上复制了Pygo2基因缺失，从而产生了与ICB的单药和组合疗效，包括治疗CRPC。然而，JBC117和JBC117ana抑制Pygo2-H3K3me2相互作用的效力没有达到最好，因此实验室正在进行虚拟筛选研究，然后进行基于ELISA的验证，以确定具有更好的药物样性质的Pygo2抑制剂。

原文链接：

https://www.science.org/doi/10.1126/sciimmunol.ade4656

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