黄芫花提取物DA激活GSK-3β/β-catenin通路，改善肾脏纤维化进程！

慢性肾脏病（CKD）是全球范围内亟待解决的公共卫生难题，其发病率已攀升至成年人口的10%。据权威预测，至2040年，CKD或将跻身全球第五大主要死因，对人类健康构成巨大威胁。肾脏纤维化作为CKD的共同终末期病理改变，其持续进展将不可避免地导致肾功能衰竭甚至患者死亡。

当前，CKD的临床治疗主要依赖于糖皮质激素及肾素-血管紧张素-醛固酮信号通路阻断剂。然而，这些治疗手段的效果仍显有限，约有30~40%的CKD患者在确诊后的10-15年内仍会出现肾衰竭。此外，这些药物对肾脏纤维化的具体抑制效果尚未明确。因此，针对肾脏纤维化这一核心病理过程，开发新型抗纤维化药物已成为当前紧迫的临床需求。

经过科学研究人员的精心分离和筛选，他们从具有抗肾脏纤维化活性的中药黄芫花成分中成功分离得到16个化合物。在进一步的实验中，他们发现其中的DA（瑞香烷型二萜小分子瑞香素 A）展现出了最优异的活性，并且其治疗效果超越了目前广泛使用的纤维化治疗药物吡非尼酮（PFD）。这表明，DA能够显著抑制肾脏成纤维细胞的激活过程，有效阻断肾小管上皮细胞的间质转分化，从而显著减轻模型小鼠（UUO）的肾脏纤维化症状。该研究对于肾脏纤维化疾病的治疗具有重要的指导意义，有望为临床提供新的治疗策略。

日前，一篇名为“A Natural Small Molecule Mitigates Kidney Fibrosis by Targeting Cdc42-mediated GSK-3β/β-catenin Signaling”的文章探究了其对肾脏纤维化治疗的潜在靶点。

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DA抑制肾小管细胞上皮-间充质转化产生的成纤维细胞的激活

首先，研究探讨了DA对活化成纤维细胞特性的影响。在无TGF-β1的情况下，DA与载体处理组在成纤维细胞增殖（EdU+）方面并未出现显著差异，这表明DA对肾成纤维细胞的基础增殖能力并未产生明显影响。然而，当受到TGF-β1刺激时，成纤维细胞增殖的扩张（EdU+）得到了促进，但DA有效地阻断了这种扩张（图2A、B）。同时，伤口愈合试验也得出了类似的结论。尽管DA对静止成纤维细胞的迁移能力没有显著影响，但它成功地阻断了GF-β1诱导的成纤维细胞迁移（图2C）。为进一步验证这些发现，研究者利用pMRF进行了跨孔迁移实验。结果表明，在TGF-β1刺激条件下，DA能够有效地缓解pMRF的迁移，但在完整的pMRF细胞中并未观察到此效果（图2D）。综上所述，DA能够有效地消除活化的成纤维细胞的增殖和迁移特性。

此外，鉴于肾纤维化微环境中各类细胞因子，如血管紧张素II（Ang II）、白介素-17（IL-17）、脂多糖（LPS）、白介素-1β（IL-1β）等，在促进成纤维细胞活化方面的重要作用，研究探讨了DA是否能有效阻断这些细胞因子的促纤维化效应。DA显著抑制了这些细胞因子诱导的α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和细胞外基质（ECM）的表达（图2E）。虽然普遍认为，纤维化肾脏中的肌成纤维细胞主要来源于成纤维细胞，但研究者也假设其中部分可能来源于肾小管上皮细胞通过上皮-间充质转化（EMT）过程。因此，研究利用转化生长因子β1（TGF-β1）刺激的肾小管上皮细胞，以探究DA是否具备预防EMT的能力。结果表明，DA对EMT的抑制作用与PFD相当，具体表现为上皮标志物e-钙粘蛋白的恢复，以及间充质标志物（如纤维连接蛋白、波形蛋白和α-SMA）的减少（图2F）。

图2 DA阻断了肾成纤维细胞的活化和肾小管细胞的EMT

DA可减轻UUO小鼠模型中的肾纤维化

研究选用了UUO小鼠模型来评估DA在体内对纤维化过程的抑制作用，这是一个公认的用于研究肾小管间质纤维化的模型。实验中分别给予了低剂量（LD，10mg/kg）和高剂量（HD，20mg/kg）的DA，通过每日腹腔注射（i.p.）的方式。手术后7天，同时以PFD（250mg/kg/日，i.p.）作为阳性对照。

结果显示，与载体相比，DA显著降低了Acta2（编码α-SMA）、Col1a1和Col3a1（编码胶原）以及Fn1（编码纤维连接蛋白）的mRNA水平，并在蛋白质层面也观察到了相应的下调（图3A，B）。尤其是，低剂量DA组在抑制这些纤维化相关基因表达方面表现出了与PFD组相当的效力。同时，高剂量DA组的疗效明显优于PFD组，进一步证实了DA具有较强的抗肾纤维化活性。

此外，研究还采用了天狼星红染色来评估肾脏胶原沉积情况。结果显示，DA处理组肾脏胶原沉积明显减少（图3C）。同时，通过监测血清肝酶（天冬氨酸转氨酶AST和丙氨酸转氨酶ALT）水平以及体重变化，发现DA给药并未引起明显的全身毒性（图3D，E）。

为确保药物能够准确地到达预期的作用部位，提高疗效并减少副作用，研究采用了高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）方法对药物在不同器官中的分布进行了定量分析。在肾脏和肝脏中均检测到了DA的存在，且肾脏中DA的富集程度更高。而在肺、心脏和脾脏中，未检测到DA的存在（图3F）。

结果表明DA是一种有效的肾保护剂，能够在体内显著缓解肾小管间质纤维化，且具有较高疗效和安全性。因此，DA有望成为治疗肾脏纤维化相关疾病的潜在药物。

图3 DA可保护UUO小鼠的肾纤维化

DA减少了活化的成纤维细胞β-连环蛋白的积累

为探究DA抗纤维化的分子机制，研究对比了经DA处理与未经处理的TGF-β1激活的NRK-49F细胞的RNA测序结果。结果显示，两组间有1593个差异表达基因，其中DA处理后1074个上调，519个下调（图4A）。出乎意料的是，KEGG分析显示DA对Wnt信号通路有显著影响，而非预期的促纤维化TGF-β/Smads通路（图4B）。在静止的成纤维细胞中，β-连环蛋白表达微弱。但受TGF-β1刺激后，β-连环蛋白表达在6小时内上调，12小时达峰值后逐渐下降。DA能有效阻断TGF-β1诱导的β-连环蛋白上调（图4C）。此外，DA还能显著抑制TGF-β1刺激的β-连环蛋白在细胞质和细胞核中的积累，这是Wnt/β-连环蛋白信号激活和纤维化基因转录的关键环节（图4D、E）。

经过分析，研究推测DA可能通过介导蛋白质降解下调β-连环蛋白表达。为验证该假设，研究使用蛋白酶体抑制剂BTZM来阻断泛素-蛋白酶体系统。结果显示，在BTZM存在下，DA未能阻止TGF-β1诱导的β-连环蛋白上调，支持DA通过促进β-连环蛋白蛋白水解降低其表达的假设（图4F）。

综上所述，DA通过上调β-连环蛋白在Ser33/37/45/Thr41残基位点的磷酸化来促进其泛素化的蛋白水解，为理解DA在调控β-连环蛋白表达方面的作用提供了新视角。

图4 DA促进了β-连环蛋白在S33/37/45/T41位点的磷酸化，并靶向β-连环蛋白进行泛素-蛋白酶体降解

结论

该研究表明，从药用植物中提纯的天然小分子二萜DA是一种高效的抗纤维化药物。在小鼠模型中，DA能阻断肾成纤维细胞活化，显著减轻肾纤维化程度，效果超过阳性对照药物吡非尼酮，表明DA在抗纤维化治疗中的巨大潜力。

参考文献：

Hu X, Gan L, Tang Z, Lin R, Liang Z, Li F, Zhu C, Han X, Zheng R, Shen J, Yu J, Luo N, Peng W, Tan J, Li X, Fan J, Wen Q, Wang X, Li J, Zheng X, Liu Q, Guo J, Shi GP, Mao H, Chen W, Yin S, Zhou Y. A Natural Small Molecule Mitigates Kidney Fibrosis by Targeting Cdc42-mediated GSK-3β/β-catenin Signaling. Adv Sci (Weinh). 2024 Apr;11(13):e2307850