盘点：CRISPR/Cas9应用近期重大进展

基因组编辑技术CRISPR/Cas9被《科学》杂志列为2013年年度十大科技进展之一，受到人们的高度重视。CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列的简称，Cas是CRISPR相关蛋白的简称。CRISPR/Cas最初是在细菌体内发现的，是细菌用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。

在CRISPR/Cas9系统中，酶Cas9在DNA靶位点上进行切割，其中这种靶位点是这样确定的：一种被称作CRISPR RNA（crRNA）的RNA分子利用它的一部分序列与另一种被称作tracrRNA的RNA分子通过碱基配对结合在一起，形成嵌合RNA（tracrRNA/crRNA），然后，借助crRNA的另一部分序列与靶DNA位点进行碱基配对，以这种方式，这种嵌合RNA就能够引导Cas9结合到这个靶位点上并进行切割。在实际应用时，人们可以将tracrRNA和crRNA作为两种向导RNA（gRNA）或者融合在一起形成单向导RNA（single guide RNA, sgRNA），并被用来引导酶Cas9结合到靶DNA序列上并进行切割，其中Cas9与sgRNA一起被称作Cas9-sgRNA系统。

进一步的研究还证实，CRISPR/Cas9的基因组编辑能力只有在被称作前间隔序列邻近基序(protospacer adjacent motif, PAM)的短片段DNA序列的存在下才成为可能。只有DNA靶位点附近存在PAM时，Cas9才能进行准确切割。再者，PAM的存在也是激活酶Cas9所必需的。

接下来，小编列举最近一段时间CRISPR/Cas9基因编辑领域取得的重大进展。科学家们利用CRISPR/Cas9技术进行改造，提高其基因编辑特异性，或提高基因编辑通量，或用于治疗疾病，或用于检测不同的病毒毒株，或用于构建疾病模型，或用于对细胞中的内源性蛋白进行标记。

1. Nature子刊：首次利用CRISPR/Cas9在体内成功切除HIV DNA片段

作为一种RNA病毒，HIV是一种逆转录病毒。当感染人细胞（主要是CD4+ T细胞）时，它会将自身的RNA逆转录为DNA后插入到宿主基因组中以便进行复制和合成新的病毒颗粒。

在一项新的研究中，来自美国天普大学刘易斯-卡茨医学院的研究人员利用基因编辑技术首次成功地从活的动物基因组中切除HIV-1 DNA中的一段序列。这一突破是开发一种潜在地抵抗HIV感染的治疗策略的关键一步。相关研究结果发表在2016年5月19日那期Gene Therapy期刊上，论文标题为“Excision of HIV-1 DNA by gene editing: a proof-of-concept in vivo study”。 论文通信作者、天普大学刘易斯-卡茨医学院神经病毒学中心主任Kamel Khalili博士解释道，“在这项概念验证的研究中，我们证实我们的基因编辑技术能够高效地应用于两种小型模式动物的很多器官中，而且能够将HIV病毒DNA的较大片段从宿主细胞基因组中切除。”

这项最新研究的设计目的是专门测试这种基因编辑技术是否也能够清除转基因大鼠和小鼠体内的HIV-1，其中HIV DNA已被整合进这两种实验性转基因动物的每个器官每个细胞的基因组中。为了让这种基因编辑技术应用于活动物体内的细胞中，Khalili博士和同事们使用重组腺相关病毒（rAAV）载体运送系统。他们也对这种基因编辑系统进行基因改造以便能够切割整合到宿主细胞基因组中的HIV-1 DNA，从而导致病毒DNA片段从宿主基因组中切除。

在利用rAAV载体运送系统将 CRISPR/Cas-9分子运送到这两种转基因动物的血液中两周后，研究人员分析了从这些动物体内收集的组织中的HIV-1 DNA。分析结果证实在包括大脑、心脏、肾脏、肝脏、肺部和脾脏在内的每个组织中以及血细胞中，HIV-1 的特定DNA片段都被从病毒基因组中切除。在分析模式大鼠体内的病毒RNA时，研究人员证实这一策略显著地降低循环淋巴细胞和淋巴结中的HIV-1 RNA水平，这就表明病毒基因组片段切除显著地影响携带整合性病毒DNA的细胞中的HIV-1基因表达。

这项新研究的临床影响是深远的。这种基因编辑平台本身可能能够根除病人体内的HIV-1 DNA，但是它也是高度灵活的，可能能够潜在地与现存的抗逆转录病毒药物组合使用从而进一步抑制病毒RNA复制。它可能也能够经改造后靶向作用于发生突变的HIV-1毒株。（Gene Therapy, doi:10.1038/gt.2016.41）

2. Nature子刊：利用CRISPR/Cas9清除人T细胞基因组中的HIV-1

人免疫缺陷病毒（HIV）导致获得性免疫缺陷综合征（AIDS），即艾滋病。在一项新的研究中，来自美国天普大学路易斯-卡茨医学院（Lewis Katz School of Medicine at Temple University）的研究人员开发出一种特定的基因编辑系统CRISPR/Cas9，从而为最终治愈HIV感染铺平道路。他们证实利用这种基因编辑系统能够有效地和安全地将这种病毒从在体外培养的人T细胞的DNA中清理掉。相关研究结果于2016年3月4日在线发表在自然出版集团旗下的Scientific Reports期刊上，论文标题为“Elimination of HIV-1 Genomes from Human T-lymphoid Cells by CRISPR/Cas9 Gene Editing”。

治愈HIV/AIDS---自从上个世纪八十年代首次发现HIV以来，它已夺去了2500万多人的生命---是HIV研究的最终目标。但是一旦它整合进CD4+ T细胞---HIV感染的主要细胞---的基因组后，清除这种病毒已被证明非常困难。近期的努力有意专注于重新激活HIV以便触发强劲的免疫反应从而能够从被感染的细胞中根除这种病毒。然而，在此之前，这些“激活并杀死（shock and kill）”方法中没有一种获得成功。

Khalili博士和同事们决定尝试着一种不同的方法：利用一种独特的定制基因编辑系统CRISPR/Cas9特异性地靶向HIV-1前病毒DNA（整合到宿主细胞DNA中的病毒基因组）。他们的系统包括一种特异性地靶向T细胞基因组中HIV-1 DNA的向导RNA（gRNA），和一种切割T细胞DNA链的核酸酶Cas9。一旦Cas9在基因编辑过程中删除HIV-1 DNA序列，那么T细胞基因组的松散末端被该细胞自身的DNA修复机制重新连接在一起。

在这项新的研究中，他们着重研究HIV潜伏地和有效地感染的人CD4+ T细胞，并证实这种技术不仅将这种病毒从T细胞中清除，而且在HIV-1已被根除的T细胞中，这种系统的持续存在阻止它们再次感染。更为重要的是，他们在体外开展实验，先将来自HIV感染者的T细胞在体外进行培养，随后证实利用这种基因编辑系统处理这些T细胞能够抑制病毒复制和显著地降低病人T细胞中的病毒载量。（Scientific Reports, doi:10.1038/srep22555）

3. Cell：利用CRISPR/Cas9系统精确标记发育大脑中的内源性蛋白

在一项新的研究中，来自美国马克斯普朗克佛罗里达神经科学研究所（Max Planck Florida Institute of Neuroscience, MPFI）的Ryohei Yasuda博士和他的团队开发出一种被称作SLENDR的方法，这种方法允许对活组织样品中的神经元DNA进行精确修饰。利用这种新技术，研究人员能够可靠地在同一个细胞中利用不同的颜色同时对两种不同的蛋白进行标记。他们利用多种成像方法和DNA测序证实这种SLENDR方法真正地和准确地敲入基因。相关研究结果于2016年5月12日在线发表在Cell期刊上，论文标题为“High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing”。SLENDR的全称为CRISPR/Cas9介导同源重组修复对内源性蛋白进行单细胞标记 （single-cell labeling of endogenous proteins by CRISPRCas9-mediated homology-directed repair）。

尽管CRISPR系统强大的基因编辑能力让人印象深刻，但是它很少在操纵脑细胞DNA中取得成功，这是因为在大脑形成时，它的细胞不再分裂。尽管科学家们能够利用CRISPR相对容易地敲除大脑中的某些基因，但是细胞分裂的缺乏使得他们很难通过HDR可靠地和精确地敲入所需的基因。

为此，Yasuda和他的团队开发出一种他们称之为SLENDR的方法，该方法能够被用来准确地修饰活组织样品中的神经元DNA。在实验性模型中，研究人员选择子宫内电穿孔技术，该技术允许他们将CRISPR/Cas9系统插入到仍然在发育和分裂的胎儿期脑细胞中。因此，发生断裂的DNA仍然通过HDR进行修复，这就允许研究人员导入一种能够在显微镜下可视化观察感兴趣蛋白的基因。他们甚至能够可靠地在同一个细胞中利用不同的颜色同时对两种不同的蛋白进行标记。他们利用多种成像方法和DNA测序证实这种SLENDR方法真正地和准确地敲入基因。

在测试这种新技术时，研究人员观察到蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）α亚型的一种之前未曾描述的行为。在发育早期，大约在出生7天后，PKC α亚型被发现在神经元细胞膜中簇集，这提示着它是高度有活性的，然而在出生一个月后，它在整个神经元中广泛地扩散，这提示着在发育后期，它不再是高度有活性的。（Cell, doi:10.1016/j.cell.2016.04.044）

4. Cell：开发出低成本的基于CRISPR/Cas9的纸片诊断系统快速检测寨卡病毒

在一项新的研究中，一个由多个机构组成的由美国哈佛大学维斯生物启发工程研究所（Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering）合成生物学家James Collins博士领导的国际小组开发出一种低成本的基于试纸的快速诊断系统，该系统能够毒株特异性地检测寨卡病毒（Zika virus, ZIKV），而且它可能很快被用来在现场筛查血液、尿液或唾液样品。相关研究结果于2016年5月6日在线发表在Cell期刊上，论文标题为“Rapid, low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components”。Collins是这篇论文的通信作者。

基于Collins和他的研究团队之前的研究，Collins团队与来自美国麻省理工学院、布罗德研究所、哈佛医学院、亚利桑那州立大学、威斯康星大学麦迪逊分校、波士顿大学、康奈尔大学、加拿大多伦多大学和Addgene公司的研究人员合作，在6周时间内开发出这种快速诊断测试系统原型，并且描述了他们的检测方法。

考虑到现场使用，Collins团队设计一种简单的模块化工作流程，由三个步骤组成：扩增、寨卡病毒检测和CRISPR-Cas9辅助的毒株鉴别。作为一种源自细菌免疫系统的基因编辑机制，CRISPR-Cas9能够被用来寻找整个基因组序列，以便发现独特的遗传特征序列。利用CRISPR-Cas9优异的序列识别能力，这种诊断系统的第三部分就是CRISPR-Cas9辅助的基于纸片的诊断模块以便区别不同的遗传特征序列最少只相差一个核苷酸的毒株。

一旦样品中的RNA通过使用酶和引物的混合物进行扩增后，将一滴扩增产物溶液加入到冻干的含有细胞组分和生物蛋白的纸片上。含有扩增RNA的这滴溶液激活冻干的组分以至于纸片改变颜色，从而指示ZIKV阳性结果。尽管这种结果的肉眼读取方式类似于早孕测试纸，但是一种经过特殊设计的电子阅读器也能够被用来更快地获得结果，而且有朝一日可能能够被用来定量检测样品中的病毒载量。

如果检测到ZIKV，那么第三步涉及将样品与冻干的CRISPR-Cas9混合在一起，然后利用这种混合液润湿另一组可改变颜色的纸片。依赖于样品中含有的ZIKV毒株，这些纸片经历另一系列肉眼可观察到的颜色变化。尽管合成生物学家和遗传工程学家通常将CRISPR-Cas9放入在活细胞内发挥功能，但是Collins团队发现当在体外冻存时，它也能够发挥功能，而且在一些情形下甚至具有更好的功能。（Cell, doi:10.1016/j.cell.2016.04.059）

5. Nature：科学家利用CRISPR-Cas9技术成功构建出细胞疾病模型

为了阐明特殊基因错误如何引发疾病，科学家们需要在细胞中进行实验来研究具体突变对细胞的影响，如今来自洛克菲勒大学（Rockefeller University）和纽约干细胞研究所等机构的研究人员通过研究，利用基于CRISPR的基因编辑技术成功在细胞中重现了疾病发生的过程，相关研究刊登于国际著名杂志Nature上。

研究者Marc Tessier-Lavigne说道，这种新型技术可以帮助科学家们直接精确地将引发疾病发生的基因植入细胞中，从而获取细胞模型来进行更为深入的研究，这就为后期开发一系列人类疾病的新型疗法提供了新的希望，比如治疗阿尔兹海默氏症等。

文章中研究人员Dominik Paquet及其同事首次尝试利用CRISPR-Cas9技术在细胞中插入两种遗传突变，而这两种遗传突变和引发阿尔兹海默氏症疾病的β淀粉样蛋白的产生直接相关，随后研究者发现，这种方法的成功率较低，仅有一小部分细胞会携带上理想的基因突变。主要的问题就是CRISPR-Cas9可以持续切割细胞的DNA，而细胞的自身修复细胞会不断修复每一个切割处直到细胞产生一种可以抑制切割的错误，而这种错误一旦产生就会在细胞中不断产生很多新型未知的问题。

随后科学家们评估了另外一种方法，即引入大块的突变来抑制后期的切割现象，通过在CRISPR-Cas9靶向检测的DNA不同部位中引入大块突变后，研究者发现这可以明显减少意外错误产生的数量。当研究人员利用CRISPR-Cas9引入阿尔兹海默氏症的任意一种遗传突变后，他们仔细观察遗传序列后发现了一种特殊的模式，也就是说在CRISPR-Cas9切割位点和研究者引入受体细胞的突变之间存在一段序列上的距离。

随后研究者Kwart说道，序列距离较短会产生出更易于包含两种突变的细胞，而随着距离增加，编辑的成功率就会降低，而一种突变的比率和其原始基因版本的峰值之间的距离就会开始拉大；更为重要的是研究者发现了特殊的距离关系，这样他们就有可能制造出大量的杂合细胞；而利用上述技术研究人员就可以对干细胞的基因组进行编辑使细胞包含两种阿尔兹海默氏症基因中的任意一种，随后诱导这些干细胞转化成为神经元细胞并且产生大量β淀粉样蛋白，从而模拟阿尔兹海默氏症的疾病表现。（Nature, doi:10.1038/nature17664）

6. Genome Res：新方法让CRISPR-Cas9飞得更高

CRISPR-Cas9是一种非常优秀的工具 ，但是这种技术也并不完美。在使用时，它有时会在未曾预料的脱靶位点上产生插入和缺失(insertions and deletions, indel)。鉴于预料之外的基因切割可能导致意想不到的突变，因此检测CRISPR-Cas9基因编辑过程中发生的任何错误是至关重要的。

在一项新的研究中，Jin-Soo Kim团队提供一种被他们称作多重Digenome-seq (digested genome sequencing，即酶消化基因组测序)的工具，能够同时地绘制出几种CRISPR-Cas9核酸酶的全基因组特异性，并且能够很快地和低成本地发现想要的和不想要的indel。相关研究于2016年1月19日提前发表在Genome Research期刊上，论文标题为“Genome-wide target specificities of CRISPR-Cas9 nucleases revealed by multiplex Digenome-seq”。

论文第一作者Daesik Kim解释道，“Digenome-seq不同于其他的基于细胞的方法，这是因为它在体外而不是在细胞内检测不含细胞的基因组DNA上的切割位点。”利用不含细胞的DNA的优势在于它产生精确的分析结果，这是因为通常在细胞中发现的染色质不会干涉这一分析过程。再者，在研究前，待研究的DNA并不需要利用PCR进行大量扩增，因此Digenome-seq比之前的方法更加简单、快速和廉价。Digenome-seq靠将不含细胞的靶DNA与Cas9核酸酶和单向导RNA(sgRNA)在体外结合在一起而运作。sgRNA引导Cas9到DNA上的靶位点和脱靶位点上，在那里，Cas9 能够进行切割。

在这项研究中，研究人员利用多重Digenome-seq工具在体外鉴定出能被切割的靶位点和脱靶位点，从中找出上百个能够潜在导致意料之外突变的脱靶位点，并在细胞内测量了这些脱靶位点的indel发生频率。他们然后利用一种他们自己开发的被称作脱靶效应指数(off-target effect index, OTI)的体系对它们的准确性进行评分。OTI体系会比较每种sgRNA的脱靶频率(off-target frequency)与在靶频率(on-target frequency)的比值。

不同于Jin-Soo Kim团队去年发表在Nature Methods期刊上的单重Digenome-seq工具(论文标题为“Digenome-seq: genome-wide profiling of CRISPR-Cas9 off-target effects in human cells”)，即一次只能分析一种sgRNA，多重Digenome-seq可同时分析多种sgRNA从而能够同时检测它们的靶位点和脱靶位点。这种多重分析过程比之前的方法更加迅速、高效和节约成本。除了快速外，多重Digenome-seq也能够比诸如HTGTS或Guide-seq之类的其他方法检测出更多的脱靶位点indel。（Genome Research, doi:10.1101/gr.199588.115）

7. PNAS：CRISPR-Cas9系统构建心脏衰竭小鼠模型

突变体小鼠模型为我们研究个别基因对发育、生理以及疾病发生等科学问题提供了极大的便利。然而，传统的小鼠突变体模型构建是一项十分耗时耗力的工程。最近的CRISPR-Cas9系统对于动物体的遗传修饰是一项革命性的突破。

最近，来自西南医学中心再生医学研究中心的Eric N. Olson研究组构建了在心肌细胞中特异性表达Cas9的小鼠，之后利用腺病毒介导的针对Myh6基因的sgRNA的感染，成功得到了心肌细胞特异性Myh6基因敲除的小鼠。相关结果发表在最近一期的《PNAs》杂志上。

首先，作者介绍了他们构建Myh6基因条件性敲除小鼠的过程，方法已经在上述内容中介绍过了。之后他们通过生化与成像的方法证明该小鼠在心肌细胞内Myh6基因得到了敲除。

进一步，作者发现这一突变体小鼠患有心脏衰竭与异常肥大症。相比野生小鼠，突变体小鼠心肌缩短率有明显的降低。之后，作者从小鼠体内分离出Cas9阳性的心肌细胞，进行体外sgRNA刺激。结果显示，Myh6特异性的sgRNA诱导能够造成心肌细胞的增大与延长。

综上，作者利用心肌细胞特异性CRISPR-cas9基因编辑技术构建了小鼠心脏疾病模型，该技术对于后续的组织特异性基因修饰具有重要的指导意义。（PNAS, doi:10.1073/pnas.1523918113）

8. Science：科学家利用CRISPR技术或可成功治疗人类遗传性疾病
如今科学家已经可以利用CRISPR技术成功治疗患杜氏肌营养不良症的成体小鼠了，而这也首次证明了CRISPR技术可以成功治疗活体动物机体的遗传性疾病，为后期开发潜在的人类遗传疾病的治疗手段或会带来一定帮助。此前来自杜克大学的研究人员利用CRISPR技术成功修正了杜氏肌营养不良症病人培养细胞中的遗传突变，而其它实验室也在实验室的条件下修正了单一胚胎中的突变基因。

这项刊登在国际杂志Science的研究论文中，来自杜克大学的研究人员通过名为腺伴随病毒（AAV）来运输基因编辑系统，成功克服了当前该领域的多种技术障碍。本文研究中研究者讨论了利用CRISPR技术纠正人类胚胎中的遗传突变，而其同时也引起了多方的关注；但利用CRISPR技术来修正患者受影响组织中的遗传突变目前并没有被讨论。

该项研究中，研究人员利用小鼠模型进行研究，小鼠模型机体的肌营养不良蛋白基因的一个外显子出现了一定的突变，研究者就对新型的CRISPR/Cas9系统重编程来切断这种异常的外显子，使得小鼠机体自然的修复系统可以对存留的基因进行修正从而产生缩短但功能正常的外显子基因。

研究者Gersbach及其研究小组首次将这种疗法应用于成体小鼠的腿部肌肉中，从而成功恢复了小鼠机体中功能性的肌营养不良蛋白并且增加了其肌肉的强度，随后研究者将CRISPR/AAV组合注射到了小鼠的血液中让其流到每一个肌肉组织中去，结果显示这些血液流经的肌肉组织的功能都得到了一定的修正，其中就包括心脏组织。（Science, doi:10.1126/science.aad5143）

9. Science重大突破：攻克CRISPR-Cas9基因组编辑的主要障碍

来自麻省理工学院-哈佛医学院Broad研究所和麻省理工学院McGovern脑研究所的研究人员，设计改造了革命性的CRISPR-Cas9基因编辑系统，大大减少了“脱靶”编辑错误。这一完善的技术解决了使用基因组编辑时面对的一个主要技术问题。

CRISPR-Cas9系统是通过对细胞的DNA进行精确地靶向修饰来发挥作用。借助于与靶位点序列相匹配的一段短RNA分子，Cas9蛋白可改变指定位点的DNA。尽管Cas9能够高度有效地切割它的靶位点，这一系统有一个主要的缺点：就是一旦进入到细胞中，它可以结合并切割额外的非目标位点。这有可能会造成意外的编辑，完全改变基因表达或是敲除掉某一基因，导致癌症形成或其他的问题出现。

在发表于《科学》(science)杂志上的一篇新研究论文中，张锋（Feng Zhang）和同事们报告称，在构成化脓性链球菌Cas9酶的约1，400个氨基酸中，他们通过改变3个氨基酸将“脱靶编辑”显着减少至无法检测到的水平。

张锋和同事们利用Cas9蛋白的结构知识：负电荷的DNA结合到了Cas9蛋白一个正电荷的凹槽中，来减少了脱靶切割。知道了这一结构，科学家们可预测出用一些中性氨基酸来替代正电荷的氨基酸，相比于“靶向”序列，可以大大减少Cas9与“脱靶”序列的结合。

在试验了各种可能的改变后，张锋研究小组发现三个氨基酸突变可大大减少“脱靶”切割。利用测试的导向RNAs，研究人员证实“脱靶”切割已降低至检测不到的水平。（Science, doi:10.1126/science.aad5227）

10. Nat Methods：新技术可大大改善CRISPR/Cas9系统的准确率

美国麻省大学医学院的科学家开发的新型CRISPR/Cas9技术可以足够精确地在几乎任何基因组的位点处对DNA进行切割，同时还可以避免潜在的在标准CRISPR基因编辑技术中发现的有害的脱靶性改变，近日，研究者通过将CRISPR/Cas9系统同可编程的DNA结合结构域（CRISPR/Cas9-pDBD）相结合，开发出了一种附加的校对步骤，其可以有效改善基因编辑系统的精确性，同时为开发潜在的基因疗法提供希望，相关研究刊登于国际杂志Nature Methods上。

研究者Scot Wolfe博士表示，标准的CRISPR/Cas9系统善于在体外利用单链引导的RNA来对基因组进行切割，理想状况下这种技术可以应用于大部分的基因疗法中，包括对大量细胞进行编辑来尽可能减小对基因组的附带损伤；文章中研究人员给CRISPR/Cas9系统中添加了一种额外的校对步骤，通过将锌指DNA结合结构域融入到CRISPR/Cas9系统中就可以明显改善CRISPR/Cas9系统的精确性，大约可以改善大约100倍的精确性。

如今研究人员正在开发新型的核酸酶平台用于切除感染细胞中的潜在的HIV原病毒，同时修饰引发慢性肉芽肿病的遗传突变。文章中科学家们利用人工引导的RNAs来对CRISPR/Cas9进行重编程从而清除哺乳细胞基因组中的特殊序列，也可以在细胞的遗传信息中插入新的片段，因此CRISPR/Cas9系统是一项革命性的医学进步，其可以很容易地对细胞中的基因进行失活的活化操作。（Nature Methods, doi:10.1038/nmeth.3624）