Nature：揭秘线粒体遗传变异：对神经退行性疾病治疗的新启示

引言

在细胞发育、疾病和衰老过程中，野生型和突变型线粒体DNA（mtDNA）共存现象称为异质性（heteroplasmy），其水平在不同生物状态下会动态变化。4月24日发表于Nature的研究“Single-cell analysis reveals context-dependent, cell-level selection of mtDNA”，着眼于线粒体DNA（mtDNA）的细胞水平选择与异质性。研究通过结合精确的mtDNA碱基编辑技术（DdCBE）和新方法SCI-LITE（单细胞组合索引技术），揭示了在标准培养条件下，细胞群体会清除非同义mtDNA变异，而保留同义变异，表明选择作用而非简单的漂移在塑造群体异质性中起主导作用。同时，研究还追踪了单细胞mtDNA异质性及其血统，发现尽管群体异质性发生了变化，但单个细胞系的异质性保持稳定，这表明选择作用是在细胞健康的层面上。

此外，通过将细胞置于特定环境中，研究显示在需要降低生化复合体I（complex I）活性的环境中，可以促使细胞积累高水平的截断型complex I mtDNA异质性，这对细胞健康可能是有益的。这些发现不仅对理解mtDNA在细胞中的动态变化具有重要意义，而且对于探索与年龄相关的退行性疾病的发生机制及其可能的遗传基础提供了新的视角。

综上所述，该研究强调了细胞环境对mtDNA异质性动态的影响，并提出了在细胞分裂过程中，非同义异质性的选择性清除，支持了一个全新的观点：即mtDNA的选择不仅仅是随机事件，而是一个复杂的、受多种因素影响的过程，其中细胞健康水平和外部环境条件起着决定性作用。这项研究不仅为我们提供了关于mtDNA异质性的深入了解，也为未来可能的治疗策略提供了理论基础。

Highlights

精确的mtDNA编辑技术（Precise mtDNA Base Editing）

该研究成功应用了精确的线粒体DNA碱基编辑技术（DdCBE），这一技术能够精确地修改单细胞中的mtDNA，进而研究不同mtDNA变异对细胞行为的影响。通过这种方法，研究人员能够在细胞水平上观察到mtDNA异质性（heteroplasmy）的动态变化，并揭示了这些变化是如何通过选择而非随机漂移来驱动的。

高通量单细胞异质性分析工具SCI-LITE（High-Throughput Single-Cell Heteroplasmy Analysis with SCI-LITE）

研究中引入了一种新的单细胞组合索引技术（SCI-LITE），该技术能够在超高通量情况下追踪单细胞的mtDNA异质性。SCI-LITE的使用大幅提升了研究的灵敏度和扩展性，使得科学家可以更加详细地分析和理解mtDNA在单个细胞中的行为及其变化。

环境依赖的选择作用（Environment-Dependent Selection）

该研究发现，细胞在不同的培养环境中展现出不同的mtDNA异质性动态。在某些环境中，特定的非同义（nonsynonymous）mtDNA变异会因为对细胞健康（cell fitness）有益而被积极选择。这一发现表明，mtDNA异质性的变化与外部环境条件密切相关，环境因素可以显著影响mtDNA的选择过程。

对细胞健康的影响（Impact on Cell Fitness）

研究展示了mtDNA异质性如何影响细胞的生长与增殖能力。通过详细分析不同异质性水平的细胞，研究指出非同义异质性通常对细胞健康有负面影响，但在特定条件下这种影响可以转变为正面。这种现象在mtDNA研究领域提供了新的见解，对于理解复杂I（complex I）功能障碍在疾病中的角色尤为重要。

Strategies

研究团队从线粒体DNA异质性（mtDNA heteroplasmy）的动态变化入手，探讨在细胞发展、疾病和衰老中这些变化的内在机制。特别关注的是，这些变化是通过随机漂移（drift）还是通过选择（selection）来推动的，以及这些过程在细胞层面还是细胞内层面发生。

精确的mtDNA碱基编辑技术（DdCBE）

研究中使用了一种称为DdCBE的线粒体碱基编辑技术，这种技术允许研究者在不使用CRISPR的情况下精确修改mtDNA。通过这种技术，研究人员可以引入同义（synonymous）和非同义（nonsynonymous）突变，进而观察这些突变如何在细胞中影响mtDNA的异质性水平。

单细胞组合索引技术SCI-LITE

为了在单细胞水平上分析mtDNA异质性，研究团队开发了一种名为SCI-LITE的新方法。这种方法结合了单细胞组合索引（single-cell combinatorial indexing, SCI）和灵敏的单细胞RNA测序技术，允许研究人员在极高的通量下测定特定转录物。SCI-LITE技术通过多轮的池化（pooling）和分裂（splitting）过程，利用条形码（barcodes）和独特分子标识符（unique molecular identifiers, UMIs）对单个细胞进行标记。

环境因素的考察

研究进一步探讨了环境因素如何影响mtDNA异质性的选择。通过将细胞置于依赖或不依赖线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）的不同能量来源环境中，研究团队观察到非同义突变的mtDNA在特定条件下如何被选择性保留或清除。这一发现提示，mtDNA异质性的选择不仅受到遗传变异的影响，还受到外部环境的强烈影响。

异质性动态的追踪

通过SCI-LITE技术，研究人员能够跟踪细胞群体中的异质性动态以及单个细胞系的异质性稳定性。这种技术的应用提供了一种全新的视角来理解mtDNA异质性是如何在不同细胞状态和环境压力下变化的。

Behind the Scenes

线粒体DNA碱基编辑技术（DdCBE）

线粒体DNA碱基编辑技术（DdCBE）是一种特别设计的技术，用于在不依赖CRISPR系统的情况下精确编辑线粒体DNA（mtDNA）。此技术利用了一种被称为“去氨基酶”（deaminase）的酶，该酶可以特异性地修改DNA碱基，从而引入突变。在DdCBE中，去氨基酶被融合到一个特定的DNA结合蛋白上，这使得编辑复合物能够精确地靶向mtDNA，并引入所需的突变。

碱基转换机制

DdCBE技术主要利用的是一种称为胞嘧啶去氨基酶（cytidine deaminase），它能够将胞嘧啶（C）转换为尿嘧啶（U）。在DNA复制过程中，这种转换可以导致碱基对从C-G变为T-A，从而在DNA序列中引入点突变。这种编辑技术不需要DNA切割或双链断裂，从而减少了细胞修复过程中可能引入的额外突变。

实验流程

在开始实验之前，研究者需要设计特定的融合蛋白，包括选择合适的DNA结合域来确保蛋白能够精确地靶向特定的mtDNA区域。这通常涉及到对mtDNA的序列进行详细分析，以识别可以作为结合位点的序列。

构建所需的融合蛋白是实验的第一步。这涉及到将去氨基酶基因与特定的DNA结合蛋白基因（如TALE或其他DNA结合模块）通过分子克隆技术融合。然后通过常规的细胞生物学方法将构建的质粒转染入细胞中。

转染后，融合蛋白会进入细胞并最终靶向线粒体。蛋白的定位标签（如线粒体定位序列）确保了蛋白能够正确地传输到线粒体内部。

一旦融合蛋白到达线粒体，去氨基酶就会活化并开始编辑靶向序列附近的碱基。这个过程通常在细胞分裂过程中发生，当DNA复制时，引入的U会被视作T，导致碱基对的永久改变。

实验的最后一步是验证编辑的效果。这通常涉及到使用PCR技术扩增编辑区域的mtDNA，然后通过测序来确定是否成功引入了预期的突变。此外，还需要评估编辑的特异性和效率，以确保没有在非目标区域引入突变。

高通量单细胞异质性分析工具SCI-LITE

SCI-LITE（Single-Cell Combinatorial Indexing Leveraged to Interrogate Targeted Expression）是一种革新的高通量单细胞分析工具，用于研究线粒体DNA（mtDNA）的异质性（heteroplasmy）。它结合了单细胞组合索引（Single-Cell Combinatorial Indexing, SCI）和靶向表达查询技术，能够在单细胞水平上同时分析多个转录物。

SCI-LITE技术首先利用一个固定和渗透的细胞样本，将这些细胞分配到多孔板中的独立孔内。在每个孔中，针对特定基因的反转录（Reverse Transcription, RT）引物被使用，这些引物带有特异的条形码（Barcode），允许后续通过序列来识别来自不同细胞的转录物。细胞被再次混合和重新分配到新的孔中进行配对末端标记（ligation），添加第二个唯一分子标识符（Unique Molecular Identifier, UMI）和第二个条形码。这一步骤提供了进一步的组合多样性，极大地提升了能够标记的单个细胞的数量。最后，进行PCR扩增，引入额外的条形码并为测序做准备。

SCI-LITE的优势

高通量与灵敏度

SCI-LITE技术的设计使其具有极高的通量和灵敏度，可以处理数以万计的单细胞样本，同时保持每个细胞的独特识别。这种高通量能力特别适合进行大规模的生物医学研究，如探索异质性在多种疾病中的作用。

成本效益

相较于传统的单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，SCI-LITE通过使用组合索引减少了必需的测序深度，从而降低了成本。这种方法通过减少必需的测序循环次数，同时提供相似或更高的数据质量，使其在资源有限的情况下成为更优的选择。

灵活性与可扩展性

SCI-LITE允许研究者针对特定基因集进行定制化分析，这增加了方法的灵活性，使其可以针对不同的研究目的进行优化。此外，该技术的设计支持横向扩展，可用于更大规模的样本处理。

减少样本损失

通过在多孔板中进行处理和条形码的添加，SCI-LITE最大化了样本的利用率，减少了在传统单细胞分离和处理中常见的细胞损失。这对于处理珍贵或难以获取的生物样本尤为重要。

环境依赖的选择作用（Environment-Dependent Selection）

在研究中，环境依赖的选择作用（Environment-Dependent Selection）指的是线粒体DNA（mtDNA）异质性在不同环境条件下如何受到自然选择的影响，导致特定的mtDNA变异在某些环境中得以保留或消除。此研究探讨了细胞在不同能量需求环境下对mtDNA变异的选择响应。

研究人员利用高通量单细胞异质性分析工具SCI-LITE对经过特定mtDNA基因编辑的细胞群体进行了分析。通过改变培养基中的糖类来源（如葡萄糖（Glucose）和半乳糖（Galactose）），模拟不同的细胞代谢需求环境。葡萄糖作为一种高效的能源物质，而半乳糖则迫使细胞依赖于线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）来产生能量。

在不同的培养条件下观察并记录了含有同义和非同义突变的mtDNA的异质性水平。使用SCI-LITE技术，研究人员能够准确测量单个细胞中特定mtDNA突变的频率，并跟踪这些频率在不同培养条件下的变化。

在葡萄糖环境中，非同义突变的mtDNA异质性水平有所下降，表明这些突变对细胞代谢在高能源条件下可能具有负面影响。

在半乳糖环境中，这种下降更为显著，表明当细胞依赖于OXPHOS时，非同义突变对细胞生存的负面影响更大。

同义突变的异质性水平在两种条件下均保持稳定，说明这些突变不影响细胞的能量代谢。

潜在的局限性

环境因素的高度依赖性（High Dependency on Environmental Factors）

该研究突显了环境因素对mtDNA异质性（mtDNA heterogeneity）影响细胞健康（cell fitness）的重要性。虽然环境敏感性是该研究的一个创新点，但这也意味着其结论可能不适用于不同的生理或病理环境。环境的高度依赖性限制了研究结果的普适性，因为不同环境下的细胞反应可能截然不同。

数据的代表性和适用性限制（Limitations in Data Representativeness and Applicability）

尽管研究使用了先进的单细胞测序技术（SCI-LITE）来分析异质性动态，但所研究的细胞类型和条件可能不完全代表人体内更广泛或复杂的生物系统。此外，实验条件的人工设置可能影响了研究结果的生物医学适用性，因为体外实验条件往往无法完全模拟生物体内的复杂互动和微环境。

异质性动态的解释挑战（Challenges in Interpreting Heteroplasmy Dynamics）

研究中对异质性水平的变化进行了详细的观察和分析，但解释这些动态仍然具有挑战性。异质性的测量和解释依赖于高度专业化的技术和分析方法，这可能限制了研究的可重复性和其他科研人员的验证工作。此外，对异质性影响的机制理解还不完全，可能需要进一步的研究来阐明这些复杂的分子过程。

潜在的研究方向

理解mtDNA异质性动态

该研究结合使用mtDNA碱基编辑和一种新方法SCI-LITE来研究单个细胞中异质性水平如何随时间变化。这揭示了异质性可以受到遗传选择和环境因素的影响，这取决于细胞环境。未来的研究可更深入地探索这些动态如何受到不同细胞环境或应激条件的影响。

单细胞mtDNA分析技术

SCI-LITE提供了一个高度可扩展和成本效益高的工具，用于详细的单细胞分析。进一步的研究可集中在提高这种技术的分辨率或效率上，以便于在生物医学研究中的更广泛应用，例如在更复杂或多样化的组织类型中。

对线粒体疾病和衰老的影响

研究表明，异质性水平在许多神经退行性疾病或代谢障碍等线粒体功能障碍是关键因素的疾病中可能是关键的。未来的研究可将特定的异质性变化模式与疾病进展或结果联系起来，可能产生针对性的治疗方法。

环境与遗传选择的交互作用

该研究还强调细胞环境如何显著影响对mtDNA变体的选择压力。遗传特征与环境条件之间的这种相互作用为研究环境或治疗手段如何有益地调节这些动态提供了研究路径。

在研究和治疗中使用mtDNA编辑

随着CRISPR-free mtDNA碱基编辑等工具的使用，有潜力直接操纵线粒体遗传学。未来的方向可能包括开发更精确的编辑工具或方法，这些工具或方法可以安全地应用于临床环境中，以纠正病理性mtDNA突变。

原文链接

Kotrys AV, Durham TJ, Guo XA, Vantaku VR, Parangi S, Mootha VK. Single-cell analysis reveals context-dependent, cell-level selection of mtDNA. Nature. 2024 Apr 24. doi: 10.1038/s41586-024-07332-0. Epub ahead of print. PMID: 38658765.https://www.nature.com/articles/s41586-024-07332-0