Adv Sci 山东大学齐鲁医院张澄/张猛教授团队揭示NKRF在心肌梗死后心脏重构中的作用及机制

心脏重构是几乎所有心血管疾病的共同病理改变，可导致心功能障碍，增加心力衰竭的发病率和死亡率。缺血性心脏病和由心肌梗死(MI)引起的心力衰竭仍然是全球主要的死因。MI后的瘢痕形成在早期阶段起着防止心室破裂和在晚期阶段维持泵血功能的重要作用。在生理条件下，细胞外基质(ECM)作为机械支架传递信号；在病理条件下参与瘢痕形成、心脏重构和心脏功能维持。心脏成纤维细胞(CFs)是心脏中最丰富的细胞类型，对调节ECM起着重要作用。MI后的心脏修复是一个精细协调且复杂的一系列事件，在早期炎症/坏死阶段适当且及时地限制炎症程度和持续时间是决定晚期纤维化/增殖阶段梗死愈合质量的重要因素。

NF-κB抑制因子(NKRF)是由X染色体上的基因编码的转录抑制因子，已有研究表明NKRF作为关键转录调节因子在多种不同疾病中发挥保护作用。然而，目前尚不清楚NKRF是否参与调节心脏成纤维细胞功能以及NKRF在心肌梗死后心脏重构中的作用及机制。

2023年9月5日，山东大学齐鲁医院络病理论创新转化全国重点实验室和心内科张澄教授/张猛教授团队在Advanced science杂志在线发表了题为“NKRF in Cardiac Fibroblasts Protects Against Cardiac Remodeling Post-Myocardial Infarction via Human Antigen R”的研究论文，阐述了NKRF对心脏成纤维细胞功能的影响，以及心脏成纤维细胞NKRF在保护心肌梗死后心脏重构中的作用及机制。该研究提示NKRF可能成为治疗病理性心脏重构的潜在靶点。

首先，研究人员观察到NKRF在心肌梗死小鼠模型梗死边缘区表达明显下调，免疫荧光证实CFs中NKRF表达明显减少；同样，在高血压小鼠模型纤维化心脏组织的CFs中发现NKRF表达也明显降低。这提示CFs中NKRF可能在病理性心脏重构中发挥作用。体外实验进一步表明炎症因子TNFα明显抑制了CFs中NKRF的表达，且这种降低主要发生在CFs胞核中。

为了研究CFs中NKRF在心肌梗死后心室重构中的作用，研究人员构建了CFs中NKRF基因敲除小鼠(NKRF-CKO)，并给予NKRF-CKO和同窝对照小鼠(NKRF^F/F)心肌梗死手术或假手术处理。超声心动图和心脏磁共振结果显示，与NKRF^F/F相比，NKRF-CKO小鼠有更大的左室收缩末期/舒张末期直径和更低的心功能；Masson染色显示，NKRF-CKO小鼠有更大的梗死面积；梗死边缘区组织蛋白WB结果显示，NKRF-CKO小鼠的MMP2和MMP9表达明显增加，而CollagenⅠ和CollagenⅢ未见明显改变；统计生存率发现，NKRF-CKO小鼠的生存率明显低于NKRF^F/F小鼠，并且NKRF-CKO小鼠有更高的心重体重比。对所有死亡小鼠尸检发现，NKRF^F/F小鼠中有40%伴有心脏破裂引起的血胸，而NKRF-CKO小鼠中有73.1%出现相同情况。其余死亡小鼠均伴有肺水肿。

体外实验证实，NKRF明显抑制了TNFα诱导的CFs迁移和侵袭的增加，这种现象由NKRF下调MMP2和MMP9表达导致。并且发现MMP2和MMP9的变化在mRNA和蛋白水平变化一致，推测NKRF调控MMP2和MMP9表达是在转录或转录后水平。ChIP实验表明，NKRF并未能通过结合经典启动子区域内NRE (negative regulatory element)序列靶向MMP2和MMP9启动子区域。接着研究人员利用放线菌素D进行mRNA半衰期实验，发现NKRF过表达明显促进了Mmp2和Mmp9 mRNA的降解。以上实验表明，NKRF调控MMP2和MMP9表达是在转录后水平。接下来研究人员发现NKRF明显抑制了TNFα和MI诱导的mRNA稳定蛋白HuR的表达，RIP实验表明NKRF明显抑制了HuR对Mmp2和Mmp9 mRNA的富集，过表达HuR挽救了这一现象;半衰期实验显示，过表达HuR明显部分挽救了NKRF对Mmp2和Mmp9 mRNA稳定性的抑制。

为了明确NKRF如何调控HuR表达，研究人员在HuR启动子区域发现了与NRE有相似序列的一段碱基，为了进一步证明NKRF通过结合HuR启动子的NRE序列调控HuR表达，研究人员通过删减NRE序列，并利用双荧光素酶报告基因、ChIP、IF共定位及Co-IP技术，证明了NKRF通过依赖NF-κB的机制与HuR启动子NRE序列结合，从而抑制HuR的转录。

研究人员进一步在体外实验中表明，过表达HuR明显逆转了NKRF过表达对MMP2和MMP9表达的抑制和对CFs迁移和侵袭的抑制。体内实验发现，HuR敲降明显挽救了NKRF-CKO小鼠MI后恶化的心功能、梗死面积、心重体重比、梗死边缘区MMP2和MMP9表达以及生存率。为了进一步探索NKRF在MI后心室重构中的潜在治疗作用，研究人员在C57BL/6J小鼠尾静脉中注射了AAV-Nkrf，结果显示NKRF过表达显著改善了MI后恶化的心功能、扩大的梗死面积、增加的心重体重比和梗死边缘区MMP2、MMP9表达以及更低的生存率。进一步通过尾静脉注射AAV-HuR的形式过表达HuR显著逆转了NKRF改善的心功能、梗死面积、心重体重比、梗死边缘区MMP2和MMP9表达以及生存率。

综上所述，NKRF在病理性重构的心脏组织CFs中表达明显降低。NKRF通过抑制MMP2和MMP9的表达，从而抑制了CFs的迁移和侵袭；机制上，NKRF通过与HuR启动子区的经典负性调控元件NRE结合，以依赖NF-κB通路的形式抑制HuR的转录，进而减少了HuR对MMP2和MMP9 mRNA稳定性的影响。NKRF明显保护了心肌梗死后小鼠的心脏功能、梗死面积和生存率。上述发现可能为预防和治疗病理性心脏重构提供新的潜在治疗靶点。

本论文的第一作者是山东大学齐鲁医院心内科博士生郭成虎，山东大学齐鲁医院心内科张澄教授、张猛教授和孔静博士为该论文的共同通讯作者。山东大学齐鲁医院为第一和通讯作者单位。

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202303283