四川大学周宗科/王端/杨佼佼团队：超声激活的益生菌囊泡涂层协同细菌类铜死亡和免疫调节抵抗钛植入物感染

骨植入体相关感染是医疗保健领域中一项严峻的挑战。植入物表面与宿主组织的相互作用为微生物定植和生物膜形成提供了理想环境，因此需要使用系统性抗生素和手术移除感染植入物。然而，耐药性、生物膜再定植以及全身毒性的风险，要求开发能够有效破坏生物膜形成并促进组织整合的非抗生素治疗方法。因此，开发具有优异界面骨整合、抗感染性和成骨活性的骨植入物显得尤为重要。

为了解决骨植入体感染问题，四川大学华西医院骨科周宗科教授/王端副研究员和华西口腔医院杨佼佼副研究员提出了一种超声激发的钛植入体涂层。该涂层通过超声触发的细菌类铜死亡，成功提升了声动力疗法对骨植入物细菌感染的治疗效果。该涂层结合了铜基金属有机框架(Cu-TCPP)和益生菌衍生外膜囊泡(OMVs)。在超声刺激下，Cu-TCPP将氧气转化为有毒的单线态氧(¹O₂)，同时产生的氧气消耗形成了缺氧环境，从而激活了替硝唑(TNZ)的抗菌活性。此外，Cu-TCPP释放的Cu(II)离子在超声和内源性谷胱甘肽(GSH)以及外源性聚单宁酸(pTA)的作用下转化为Cu(I)离子，过量的Cu(I)干扰细菌代谢，导致类似于铜死亡的细菌死亡。同时，OMVs促进巨噬细胞向M2型抗炎表型极化，减轻炎症反应，增强骨生成因子的表达，促进骨修复和植入物的整合。该涂层通过SDT、缺氧激活疗法和铜诱导的细菌死亡实现了对生物膜感染的长效抗菌效果，并通过OMVs介导的免疫调节促进了骨修复。相关研究发表在《Advanced Materials》上，题为“Ultrasound-Activated Probiotics Vesicles Coating for Titanium Implant Infections Through Bacterial Cuproptosis-Like Death and Immunoregulation”。

【文章亮点】

引入通过声动力疗法和替硝唑(TNZ)增强生物膜缺氧和即时细菌消除的新方法，解决了当前声动力疗法在治疗生物膜方面的局限性，通过增强生物膜的缺氧环境激活TNZ，实现即时和有效的细菌清除，同时提出通过聚单宁酸(pTA)的氧化还原调节诱导细菌可控的类铜死亡机制，克服Cu(I)离子在水溶液中的不稳定性，并规避细菌对类铜死亡的防御，从而实现铜离子的精准传递和显著提高细菌清除效果，此外，通过利用动物乳杆菌囊泡(OMVs)在成骨和抗炎方面的增强作用，发现了通过调节巨噬细胞向M2型极化来增强成骨和减少炎症的新途径，从而支持组织修复和再生。如图1所示，作者将乏氧条件激活的抗生素TNZ，具有良好SDT效果的Cu-TCPP金属-有机声敏剂以及OMVs用具有良好粘附性的pTA逐层负载在钛植入体上，得到CuTOT声敏涂层。其中，pTA作为还原剂调节了Cu(II)和Cu(I)之间的价态转换，从而触发Cu(I)导致的细菌类铜死亡。

图1 CuTOT钛植入物的合成和利用示意图。通过Cu-TCPP介导的SDT、缺氧激活疗法和Cu(I)过载诱导死亡的三重增强，在各阶段有效治疗IAIs。此外，骨支架在感染骨植入物模型中通过OMVs介导的疗法协同显示出免疫调节和成骨作用。

Cu-TCPP在超声刺激下能够有效生成单线态氧(¹O₂)，这一过程通过SOSG探针和DPBF探针测量得以验证（图2b-d）。电子自旋共振（ESR）谱图进一步确认了¹O₂的生成（图2e）。Cu(II)离子在超声作用下持续释放，释放曲线显示了Cu(II)的累积释放量(图2f)。在超声和pTA的作用下，Cu(II)被还原为Cu(I)，这一价态变化通过XPS谱图中的Cu(I)和Cu(II)的峰比变化得到证实。超声刺激前，CuTOT中的Cu(I)和Cu(II)的峰比为0.09，而超声刺激后，这一峰比显著增加到0.28（图2h）。表明Cu-TCPP在SDT中不仅具有高效的抗菌活性，还通过控制铜离子价态转换增强了其抗菌效果。

图2 声动力性能和体外超声激活的价态变化。a) Cu-TCPP介导的SDT示意图。b) 通过SOSG测量的Cu-TCPP的声动力活性。c,d) 随时间和不同含量的DPBF测量的Cu-TCPP的声动力活性。e) Cu-TCPP的ESR谱图。f) Cu(II)离子的累积释放曲线。g) TNZ的释放曲线。h) 超声刺激前后CuTOT中XPS谱图中932 eV处Cu(I)和Cu(II)的峰比。i) CuTOT中SDT引起的铜价态变化的机制。

图3展示了CuTOT联合US处理对细菌转录组的影响。通过KEGG富集分析（图3a）对比Ti + US和CuTOT + US处理组的代谢通路，结果显示CuTOT + US处理显著影响了细菌的代谢通路。火山图（图3b）展示了差异表达基因的分布，结果显示在CuTOT + US处理组中有568个基因显著下调，549个基因显著上调，表明CuTOT + US处理显著改变了细菌的基因表达。基于表达模式的细菌TCA循环相关基因的聚类分析（图3c）显示，CuTOT + US处理干扰了细菌的TCA循环。机制示意图（图3d）解释了CuTOT + US处理干扰TCA循环的具体机制。定量分析进一步显示，CuTOT + US处理显著抑制了丙酮酸脱氢酶（PDH）活性（图3e）和琥珀酸脱氢酶（SDH）活性（图3f），并显著降低了细菌的ATP水平（图3g）。这些结果表明，CuTOT + US处理通过干扰细菌的TCA循环、降低PDH和SDH活性及ATP水平，导致细菌代谢紊乱和死亡，从而发挥其抗菌效果。

图3 CuTOT + US处理的细菌转录组分析。a) Ti + US和CuTOT + US处理中的KEGG富集分析。b) 火山图显示差异表达的基因。c) 基于表达模式的细菌TCA循环相关基因的聚类分析。d) CuTOT + US干扰TCA循环机制的示意图。e) 相对PDH活性、f) 相对SDH活性和g) 体外相对ATP水平的定量分析。

将带菌支架植入大鼠股骨髁内构建感染性骨缺损模型，在术后给予超声治疗。术后第4周和第8周的组织学染色（H&E、Goldner和TB）显示了植入物周围骨组织的情况（图4a）。免疫荧光染色分析了巨噬细胞极化的情况，其中iNOS（M1）和CD206（M2）的染色表明，CuTOT + US处理组促进了M2型巨噬细胞的增加和M1型巨噬细胞的减少（图4b）。骨缺损中BMP2、CD31和Runx2的免疫荧光染色显示，CuTOT + US处理组在这些成骨标志物的表达上显著提高（图4c）。CD206/iNOS荧光强度比率的定量分析进一步证实了这一点（图4d），此外，BMP2、Runx2和CD31的标准化荧光强度分析结果也表明CuTOT + US处理组在成骨活性和血管生成方面有显著优势。表明CuTOT在体内具有良好的抗菌和成骨能力，可能是一种有前景的临床选择。

图4 新骨形成的微观结构和机制。a) 植入物周围骨组织在术后第4周和第8周的组织学染色（H&E、Goldner和TB）。b) 用于巨噬细胞极化的iNOS（M1）和CD206（M2）的免疫荧光染色。c) BMP2、CD31和Runx2的免疫荧光染色。d) CD206/iNOS荧光强度的比率。

参考文献：

Li S, Yue Y, Wang W, Han M, et al. Ultrasound‐Activated Probiotics Vesicles Coating for Titanium Implant Infections Through Bacterial Cuproptosis‐Like Death and Immunoregulation. Advanced Materials. 2024;2405953

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adma.202405953