长春中医药大学AFM：超声电刺激协同纳米贴片促进周围神经修复

低强度脉冲超声（LIPUS）和电刺激（ES）是促进神经修复的有效方法。然而，ES通常需要植入电极和电源供应，这对未来的应用程序来说是个不便。同时，通过传统方法很难将超声和ES结合起来。在这里，长春中医药大学附属医院杨勇&中国人民解放军总医院第四医学中心杨亚锋&北京基础医学研究所刘志强开发了一种纳米贴片，它由一个定向的钛酸钡（BTO）掺杂的聚己内酯（PCL）纳米纤维膜用于发电，以及一层掺杂氧化石墨烯（GO）的明胶甲基丙烯酸酯（GelMA）用于神经交互。这种类似创可贴的BTO@PCL/GO@GelMA纳米贴片具有出色的压电性能。体外实验表明，纳米贴片在LIPUS处理下显著促进轴突生长。在由周围神经损伤引起的勃起功能障碍的大鼠模型中，纳米贴片可以像创可贴一样轻松地附着在受损神经上。在超声波的辅助下，纳米贴片将部分机械能转换为电能，实现了超声和电的协同神经刺激。通过这种方式，纳米贴片显著促进了海绵体神经的修复，改善了组织结构和勃起功能，以及提高了雌鼠的受孕率。总之，这种纳米贴片为神经修复提供了一种易于实现的协同超声-电刺激，代表了周围神经修复的新策略。该研究以题为“An Easy Nanopatch Promotes Peripheral Nerve Repair through Wireless Ultrasound-Electrical Stimulation in a Band-Aid-Like Way”的论文发表在《Advanced Functional Materials》上。

方案 1描述了一种自驱动的创可贴型BTO@PCL/GO@GelMA纳米贴片，用于模拟应用中的周围神经电刺激修复。该纳米贴片结合了压电材料（BTO@PCL）和导电材料（GO@GelMA），能够在机械压力或应力下产生电流，用于模拟和调制生物电信号，影响细胞和组织的生理过程。在低强度脉冲超声（LIPUS）的辅助下，纳米贴片吸收的机械力被转换为微电流，以刺激神经并促进损伤修复。研究结果表明，这种纳米贴片在体外显著促进了雪旺细胞的增殖，并在体内促进了海绵体神经的轴突生长，显著改善了大鼠的勃起功能和组织结构，同时提高了雌鼠的受孕率。

方案1. 自供能创可贴型BTO@PCL/GO@GelMA纳米贴片用于周围神经电刺激修复的仿生应用及其作用原理示意图

【BTO/PCL纳米纤维膜的物理特性表征】

图1通过扫描电子显微镜(SEM)观察到PCL纤维定向排列，并且压电BTO均匀附着在PCL纤维表面。能量色散X射线光谱(EDS)分析显示，随着BTO浓度的增加，Ti、Ba和O等元素的含量也相应增加，这表明BTO纳米颗粒在PCL基体中分散，由于纳米颗粒的高比表面积和界面效应，增强了复合材料的压电性能。电性能测试显示，随着BTO浓度的增加，BTO@PCL薄膜的输出电压、电流和表面电荷均呈现依赖于BTO浓度的增加趋势。此外，机械性能测试表明，随着BTO浓度的增加，薄膜的拉伸强度和弹性模量也得到增强。压电系数d33的测定也显示了与BTO浓度增加相关的逐渐增强的趋势。细胞相容性测试表明，当BTO浓度低于5%时，RSC96细胞在BTO@PCL薄膜上展现出高增殖活性和低死亡率，而BTO浓度超过5%时，观察到更多的细胞死亡。因此，选择5%的BTO浓度来制备BTO@PCL复合纤维，既能提供有利的机械性能，又支持细胞生长。

图1. BTO/PCL纳米纤维膜的物理特性表征

【BTO@PCL/GO@GelMA纳米贴片的物理特性】

图2通过SEM观察到纳米贴片具有定向排列的电纺纤维和覆盖的凝胶层，保持了GO的优异导电性和GelMA的蜂窝状多孔结构，模仿了天然神经组织的细胞外基质特征。EDS分析证实了纳米贴片中不同组分的存在和相对含量。XRD和FTIR分析用于确定材料的结构和组成，PFM技术用于评估纳米贴片的压电活性。实验结果表明，GO的加入对复合纳米贴片的电信号有积极影响，且在LIPUS处理下，RSC96细胞的活性和增殖在60 mW cm^-2的能量强度下达到最佳效果。此外，免疫荧光染色显示LIPUS处理后RSC96细胞表达的S-100水平更高，表明通过LIPUS激活的压电材料产生的电刺激更有利于RSC96细胞的增殖。这些发现表明，BTO@PCL/GO@GelMA纳米贴片在体外对神经细胞的生长和分化具有促进作用。

图2. BTO@PCL/GO@GelMA纳米贴片的物理特性

【不同条件下体外LIPUS强度对RSC96细胞活性和增殖的影响】

图3通过CCK-8试剂盒检测了不同LIPUS能量强度（0, 20, 40, 60, 80, 和 100 mW cm^-2）对细胞活性的影响，并发现当LIPUS能量设置为60 mW cm^-2时，对RSC96细胞的活性有最佳促进效果。EdU染色用于评估LIPUS诱导的压电效应对RSC96细胞增殖的影响，结果显示与对照组相比，经BTO@PCL/GO@GelMA + LIPUS处理的细胞增殖显著增加。免疫荧光染色显示，LIPUS处理后，RSC96细胞表达的S-100水平更高，这表明由LIPUS激活的压电材料产生的电刺激更有利于RSC96细胞的增殖。此外，实验还评估了不同处理条件下神经元的生长情况，包括对照组、BPGG组（神经元在BTO@PCL/GO@GelMA纳米贴片上生长）、LIPUS组（神经元接受LIPUS处理）和BPGG + LIPUS组（神经元在BTO@PCL/GO@GelMA纳米贴片上生长并接受LIPUS处理）。免疫荧光染色的结果显示，BPGG + LIPUS组的神经元长度和最长神经元长度显著增加，表明BTO@PCL/GO@GelMA纳米贴片在LIPUS处理下产生的电刺激显著促进了神经元的生长。这些结果一致表明，电活性材料可以通过电刺激调节神经细胞的生理活动，促进神经干细胞的分化，对受损神经组织可能有助于神经再生和修复过程。

图3. 不同条件下体外LIPUS强度对RSC96细胞活性和增殖的影响以及神经元突触发展

【纳米贴片通过LIPUS改善神经损伤诱导的ED大鼠勃起功能】

图4展示了应用类似创可贴的BTO@PCL/GO@GelMA纳米贴片在大鼠模型中对勃起功能障碍（ED）进行功能性修复的效果。实验中，首先通过解剖图展示了大鼠海绵体神经的位置，然后描述了在神经损伤后如何将纳米贴片应用于受损神经。经过四周的治疗，通过测量海绵体内压（ICP）与平均动脉压（MAP）的比值来评估勃起功能，结果显示BPGG+LIPUS组（应用纳米贴片并结合LIPUS治疗的组）在ICP/MAP比值上有显著提升，表明这种联合治疗方法能显著促进神经恢复，改善勃起功能。此外，通过动物交配实验评估了雄性大鼠的生育能力，结果显示BPGG+LIPUS治疗能提高雌鼠的受孕率和生育力。最后，通过组织学分析，包括Masson三色染色和免疫组化染色，进一步证实了纳米贴片治疗组在组织结构和功能上的改善。 

图4.类似创可贴的BTO@PCL/GO@GelMA纳米贴片通过LIPUS改善神经损伤诱导的ED大鼠勃起功能

【LIPUS激活的BTO@PCL/GO@GelMA纳米贴片产生压电刺激促进轴突生长和髓鞘化】

图5通过免疫荧光染色评估了不同实验组（包括假手术组、双侧海绵体神经损伤组、单独LIPUS治疗组、以及BTO@PCL/GO@GelMA纳米贴片结合LIPUS治疗组）的神经纤维（NF）、β3微管蛋白（β3-tubulin）和S-100蛋白的表达水平，这些蛋白是神经再生和髓鞘形成的标志物。结果显示，与假手术组相比，神经损伤组的这些标志物表达显著降低，而BTO@PCL/GO@GelMA纳米贴片结合LIPUS治疗组的表达水平显著恢复。此外，对损伤诱导的转录因子ATF3的表达分析表明，BPGG+LIPUS治疗组的ATF3表达水平显著增加，这表明该治疗可能促进了损伤神经元的再生和突触重建。最后，通过透射电子显微镜（TEM）图像观察到，BPGG+LIPUS治疗组的神经结构得到了显著恢复，轴突和髓鞘的形态接近假手术组。这些结果表明，BTO@PCL/GO@GelMA纳米贴片在LIPUS激活下产生的压电刺激显著促进了神经纤维的再生和修复。

图5. LIPUS激活的BTO@PCL/GO@GelMA纳米贴片产生压电刺激促进轴突生长和髓鞘化

【纳米贴片用于修复受损的海绵体神经并改善大鼠病理性阴茎损伤】

图6通过Masson三色染色观察四周后各组大鼠阴茎组织中平滑肌与胶原蛋白的比例，发现BPGG+LIPUS组的平滑肌/胶原蛋白比例显著提高，接近正常水平。免疫组化染色结果显示，与神经损伤组相比，BPGG+LIPUS组的α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）阳性染色区域显著增加，表明治疗促进了海绵体平滑肌的修复和再生。免疫荧光染色评估了内皮细胞的分布和完整性，发现BPGG+LIPUS组的CD31表达水平最高，表明内皮细胞功能得到了显著改善。透射电子显微镜（TEM）图像和分析显示，BPGG+LIPUS组的神经纤维结构得到了显著恢复，轴突和髓鞘的形态接近假手术组。这些结果表明，BTO@PCL/GO@GelMA纳米贴片结合LIPUS治疗不仅促进了海绵体神经的结构和功能恢复，还改善了阴茎组织的病理状态。

图6. LIPUS介导的BTO@PCL/GO@GelMA纳米贴片用于修复受损的海绵体神经并改善大鼠病理性阴茎损伤

【小结】

该研究开发了一种类似创可贴的、灵活的、自供电的纳米贴片，该贴片能够通过灵敏的压电效应对周围神经进行电刺激，且无需外部电源。在低强度脉冲超声（LIPUS）的刺激下，这种电子活性纳米贴片显著增强了体外雪旺细胞的增殖，并在体内促进了海绵体神经的轴突生长，导致大鼠勃起功能障碍和病理状态的显著改善。总体而言，这种复合纳米贴片可以作为传统电刺激的一种有效替代方案，用于周围神经修复，为开发创新的治疗策略提供了新的见解。

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