Nature：肠道微生物组的黑暗面：噬菌体的未解之谜

引言

人类肠道是各种微生物的栖息地，其中包括大量对宿主健康至关重要的细菌。然而，肠道微生物组的另一个重要组成部分——病毒，尤其是噬菌体(bacteriophages)，却鲜少得到同等关注。

噬菌体是一类专门感染细菌的病毒，最早于20世纪初被发现。它们是地球上最为丰富的生物实体，据估算，每克粪便中约含有10亿个噬菌体。尽管数量惊人，肠道中的病毒群（即病毒组，virome）却仍是一个未被充分探索的领域。“噬菌体中的未知成分规模巨大，”英国莱斯特大学的Martha Clokie指出。

根据《自然》对人类微生物组的报道，研究人员迄今测序的噬菌体中，约四分之三仅感染30个细菌属。“我们的病毒组极其丰富且多样，但我们仅触及了冰山一角，”澳大利亚墨尔本莫纳什大学的噬菌体生物学家Jeremy Barr表示。

对噬菌体了解不足并非因为缺乏兴趣——美国国家卫生研究院(NIH)设有专门的项目致力于对人体肠道内病毒进行编目和表征。问题在于，这些病毒难以研究。然而，随着测序和培养技术的进步，越来越多的证据表明，噬菌体在肠道微生物组的生态系统中起着关键作用，并对人类健康产生深远影响。（10月31日 Nature “Hidden players: the bacteria-killing viruses of the gut microbiome”）

研究偏好与技术限制

研究人员对噬菌体的认识主要集中于那些感染有害细菌（如沙门氏菌属(Salmonella species)和大肠杆菌(Escherichia coli)）的噬菌体，这与利用它们来对抗病原体的兴趣有关——这一概念被称为噬菌体疗法(phage therapy)。相比之下，那些感染肠道无害共生菌的噬菌体则鲜有研究。2019年，爱尔兰科克大学的微生物学家Colin Hill及其同事对10名个体的肠道进行了测序，发现了约40,000个病毒基因片段，但其中仅241个与已知噬菌体有较高的相似性。

即便如此大量的病毒序列，仍可能低估了肠道中病毒的多样性。尽管DNA测序技术的进步增加了对双链DNA病毒的认知，但单链DNA和RNA噬菌体因设备限制和高昂的成本常常被忽视。

许多噬菌体被认为只感染特定菌株的细菌，且仅凭基因序列难以确定特定噬菌体的功能。“很多时候，我们甚至无法判断它感染的宿主是什么，”Barr表示。

2014年的一项研究中，DNA片段拼接技术揭示了crAss噬菌体(crAssphages)这一病毒家族，它们在人类肠道中极为丰富。某些crAss噬菌体的基因组大小与细菌相当；在部分个体中，这些噬菌体占据了肠道所有病毒DNA的90%。然而，当crAss噬菌体的基因与已知微生物进行交叉比对时，匹配度却极低。“这种生物在我们每个人的肠道中都有极高丰度，但我们对其40-50%的基因功能一无所知，”华盛顿大学圣路易斯分校的微生物学家Scott Handley称，“我们称之为功能暗物质(functional dark matter)。”

通过识别细菌从噬菌体捕获并插入其自身DNA的序列等技术，可以揭示哪些噬菌体感染了哪些宿主。这些序列代表了细菌的一种原始免疫记忆形式，也是CRISPR-Cas9基因编辑技术的基础。西雅图的生物技术公司Phase Genomics开发了一种方法，允许研究人员在噬菌体感染细菌细胞时捕捉其DNA，该方法通过化学交联固定与细菌DNA接触的噬菌体DNA。

然而，Hill指出，自crAss噬菌体被发现后的五年间，它们几乎只在计算机中被研究。在他看来，依赖测序是一把双刃剑。“我们对噬菌体的类型了解得更多了，但同时也逐渐远离了对其宿主培养及其生物学特性的理解，”他说。

包括Hill在内的许多噬菌体生物学家认为，现在是时候重返实验室，培养肠道细菌以揭示更多的噬菌体。“我们对噬菌体基因组的理解越来越多，但对其实际行为的理解却日渐减少，”他说。

培养之争

2007年，当Clokie在莱斯特大学成立实验室时，她注意到针对艰难梭菌(Clostridium difficile)的噬菌体研究极为稀少，而这种细菌可以引起腹部痉挛、腹泻甚至致命的下肠道损伤。“当时凭借年轻的天真和盲目乐观，我觉得这是一个有趣的病原体，无法理解为何人们未发现相应的噬菌体，”Clokie回忆道。多年后，在她最终确定了少数艰难梭菌噬菌体的活性之后，才理解了为何进展如此缓慢。

首先，艰难梭菌本身在实验室中极为难以培养。“五年前，主流观点认为大多数肠道细菌无法培养，”Barr表示。然而，如今这种观点已不再适用。“我们现在可以培养大多数肠道细菌，”他说。这些细菌可以在无氧环境中生长，并在专门的培养基中获取所需的营养。

然而，培养细菌只是第一步，接下来还需培养捕食这些细菌的噬菌体，这是Clokie和其他研究者面临的主要挑战之一。有些细菌菌株充满抗病毒的机制，使噬菌体难以成功感染。即便宿主菌株适合噬菌体复制，检测噬菌体也常常面临挑战。

经典的生物学实验之一是将大肠杆菌(E. coli)培养在培养基上，然后用噬菌体T4感染这些细菌。T4噬菌体外形如微型六足机器人，最早在1940年代被描述。噬菌体劫持细菌，迫使其生产更多噬菌体，最终裂解细菌并释放子代。这种细菌菌落的破坏可以用肉眼观察。然而，大多数感染肠道细菌的噬菌体并未表现出类似效果。“许多噬菌体不会形成空斑或清除区，因此难以检测或计数，”Hill解释道。

尽管研究人员在克服这些问题方面取得了一些进展，噬菌体的培养仍然是一个复杂且耗时的过程。这带来了资金上的挑战：难以为一种尚未获得的病毒申请到研究资金，而获得这些病毒需要耗费大量的时间、精力和资源。Clokie提到，或许可以说服某个学生承担这一挑战，但对他们来说，“这是高风险的，可能无法得到任何结果”。Hill估计，待研究的噬菌体物种多达一千万，“任务之艰巨可想而知”。

共生与调节

成功培养出噬菌体后，研究人员的观察结果有时会颠覆先前的预期。2018年，Hill报道了crAss噬菌体在肠杆菌(Bacteroides intestinalis)中的增殖。这一成果不仅使得通过电子显微镜描述病毒颗粒结构成为可能，也使团队能够研究噬菌体与宿主的相互作用。

考虑到噬菌体作为细菌“屠杀者”的声誉，Hill原以为会看到噬菌体与细菌之间的激烈对抗。然而，crAss噬菌体和细菌却安然共存，表现出一种稳定的共生关系。“细菌似乎进化出了一种机制，支持噬菌体的存在，”Hill说道。“它们并非在相互对抗，而是在共舞。”

因此，噬菌体或许应被视为肠道这一复杂生态系统中的调节因子。许多噬菌体生物学家倾向于用动物学类比来描述它们，认为噬菌体类似于非洲草原上的大型猫科动物，通过捕猎体弱或患病的个体来维持生态平衡。“狮子让羚羊群保持健康，”Hill指出——噬菌体与细菌之间的关系可能也是类似的。“这是一种共生关系，”Barr补充道，“你的病毒组使微生物组具有更多的灵活性和进化能力。”

与疾病的关联

在某些情况下，噬菌体与细菌的关系对人类健康不利。例如，志贺毒素(Shiga toxin)能够引发人类腹泻，这种毒素由某些大肠杆菌菌株中的噬菌体编码。一种解释认为，这帮助细菌抵御原生动物的捕食——对噬菌体及其宿主有利，但对人类却有不良影响。此外，噬菌体的捕食压力还会促使细菌改变其外蛋白壳，试图躲避噬菌体，这也使得它们可以逃避人体免疫系统的识别。“噬菌体使得细菌保持灵活，不断改变其结构和受体，”Hill解释道。

另一方面，肠道中噬菌体与细菌之间的复杂关系也可能对人类健康有益。肠道微生物多样性低与炎症性肠病(IBD)、艰难梭菌感染、肝病和糖尿病等多种疾病有关。噬菌体通过靶向快速增殖的细菌菌株，可能有助于保持微生物组的多样性，其中许多快速增殖的菌株往往是病原体。“噬菌体会适应并杀死常见细菌，”加州大学伯克利分校的进化生物学家Britt Koskella说道，“通过这样做，它们为稀有细菌创造了生存空间，从而增加了微生物组的多样性。”

治疗潜力与未来研究

随着研究人员对肠道噬菌体的理解不断深入，其对健康的影响也愈加清晰。测序研究揭示了健康人群与患病个体之间的噬菌体差异。“从传染病到代谢综合征，你可以看到微生物组失衡时明显的病毒特征，”Koskella表示。

Handley认为，噬菌体可能在触发IBD方面起到了重要作用。IBD是一种导致腹泻、腹痛和体重减轻的慢性病。在寻找可能解释这种疾病的病毒时，Handley发现，IBD患者肠道中的噬菌体数量显著增加。

他推测，炎症可能导致细菌受到压力，从而激活隐藏在细菌中的噬菌体，使其从“沉船”中跳脱，增加肠道中游离噬菌体的数量。“一旦发生炎症，细菌会受到压力，噬菌体便会被释放，”Handley解释说，“这些噬菌体开始重塑细菌群落。”此外，噬菌体的释放还可能进一步激发免疫反应。Handley及其同事报告称，IBD患者的病毒组会引发巨噬细胞（一种杀死微生物的免疫细胞）的促炎反应。这一逻辑推论表明，这些噬菌体可能加剧了肠道中的免疫反应和炎症。

Handley提出，某些噬菌体数量的激增可能是IBD患者炎症爆发的预警信号。他还认为，噬菌体群可能是导致IBD患者粪菌移植失败的原因之一。粪菌移植是一种通过将健康供体的粪便转移至患者体内以恢复正常微生物组的方法。“这些疗法之所以不如预期成功，可能是因为噬菌体在杀死益生菌，”他说。

噬菌体作为治疗手段

即便发现了噬菌体与疾病之间的潜在联系，研究人员也在探索如何将噬菌体用于治疗。

Hill建议，可以将益生菌与其特定噬菌体一起培养。乍一看，这种做法似乎并不受益生菌生产商欢迎——噬菌体因在奶酪生产中消灭添加至牛奶中的细菌菌株而臭名昭著。Hill承认，如果生产商刻意将噬菌体加入到益生菌培养物中，可能会导致部分培养失败。然而，这样的益处在于，存活下来的菌株更为强壮，或许在进入肠道后更能与其他细菌竞争并抵御噬菌体的攻击。

使用噬菌体本身作为疗法的尝试也在进行中。对于艰难梭菌感染，粪菌移植已被证明是一种有效的疗法。传统上，粪菌移植被视为将健康的细菌移植给患者，但噬菌体也不可避免地成为了移植的一部分。“即使在粪菌移植两年后，供体的噬菌体仍能被检测到，”Hill提到。2017年的一项研究表明，将移植材料中的细菌过滤掉，仅传递噬菌体和分子环境，对于艰难梭菌感染患者具有与完整粪便移植相似的效果。“我们将看到更多通过噬菌体微妙地调节微生物组以达到理想状态的应用，”Clokie说。

去年，国内的一项研究报告显示，在糖尿病小鼠模型中施用噬菌体混合物能够抑制机会性微生物，同时促进有益细菌的生长。今年2月，研究人员报告称，将健康小鼠的噬菌体转移至慢性应激小鼠体内，阻止了肠道细菌群和行为的预期变化。这表明噬菌体可能用于重新平衡影响脑功能的肠道微生物。

将这些初步的发现转化为有效的治疗手段仍面临重大挑战，尤其是由于噬菌体在实验室中的研究难度依然很高。但许多研究人员决心继续努力。“当我不仅有噬菌体的序列，还能实际生产和测试它们，并将它们应用于动物模型时，就能获得更多生物学上的理解，”Barr说。

这也使得与肠道共生的庞大病毒群体在人体中作为治疗手段进行测试变得更加可行。“在微生物组研究中纳入噬菌体是一个我们尚未充分利用的策略。我们应考虑将这些病毒与细菌结合应用，”Hill总结道。

参考文献

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