CAR-T细胞治疗的挑战

前言

化疗、放疗和外科手术是最传统的癌症治疗方法，但它们的疗效较低，副作用严重。因此，在过去的十年中，研究人员已经开发了新的策略，从而实现疾病的完全缓解。目前，免疫疗法已经成为革命性的癌症治疗方法，有几种类型的免疫疗法用于治疗癌症，其中包括过继细胞疗法（ACT）。

嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法是一种ACT，自体T细胞通过基因工程表达CAR以特异性杀死肿瘤细胞。CAR-T细胞疗法是治疗对其他一线癌症治疗无反应患者的一个机会，并且已经在血液恶性肿瘤的治疗中展现出优越的抗肿瘤效果。然而，这类疗法作为一线临床治疗仍有许多挑战需要克服。从药学的角度来看，这项新兴技术仍然被归类为先进疗法，因此，要应用这项技术，必须首先满足医药监管的某些要求。因此，有必要分析CAR-T细胞技术的要素和挑战，并将基础、临床和实践等方面的因素考虑在内，采取应对策略，从而使CAR-T技术能够成为可负担的治疗模式。

CAR-T细胞发展简史

回顾CAR-T的发展史，首先要提到1957年Thomas及其同事报告的首次白血病患者骨髓移植以及随后Miller等人发现了T细胞的起源。然而，直到1986年Steven Rosenberg报告了一项关于肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的研究，这才让人们将目光锁定在“患者自身的免疫细胞可以对抗自身癌症”的理念上。

1992年，Sadelain等人成功地建立了逆转录病毒介导的基因转移到T淋巴细胞的方法，使基因修饰成为在实验或治疗环境中控制免疫的手段。几乎与此同时，ZeligEshhar及其同事利用抗体结合域和T细胞受体上免疫球蛋白的γ或ζ亚单位，通过嵌合单链设计了细胞毒性淋巴细胞的特异性激活，从而开发出第一代CAR-T细胞。

五年后，Sadelain博士的研究小组证明，将CD28等共刺激信号整合到CAR-T中可增强生存、增殖并保持活性，从而开发出第二代CAR。随后，携带靶向CD19的CAR-T细胞被开发出来，并启动了慢性淋巴细胞白血病（CLL）和急性淋巴细胞白血病（ALL）的I期临床试验。试验结果证明CAR-T疗法在化疗难治性ALL的成人中诱导有效缓解，随后生物工艺生产规模扩大。

2017年，FDA批准了CD19 CAR-T细胞疗法（Tisagenlecleucel）适用于儿童和年轻人的ALL。到目前为止，FDA批准了五种用于癌症治疗的CAR-T细胞治疗药物。

CAR-T细胞治疗的临床挑战

CAR-T细胞治疗面临的挑战，主要与副作用、毒性、T细胞耗竭和恶性肿瘤微环境（TME）有关。此外，在大规模生产中的制造过程目前既耗时又昂贵，因此，使尽可能多的患者接受CAR-T细胞免疫治疗成为一个更大的挑战。

副作用和毒性

在CAR-T细胞输注后，这种免疫疗法可能具有潜在的致命毒性。据报道，一些副作用包括发热、炎症、肝酶异常升高、呼吸困难、发冷、思维混乱、头晕、严重恶心、呕吐和腹泻。所有患者均有长期B细胞再生障碍，可通过服用丙种球蛋白缓解。毒性主要有两类：细胞因子释放综合征（CRS）和神经毒性（NTX）或CAR-T细胞相关脑病综合征（CRES）。

CRS或“细胞因子风暴”是一种全身炎症反应，由大量活化淋巴细胞（B细胞、T细胞和自然杀伤细胞）以及髓系细胞（巨噬细胞、树突状细胞和单核细胞）引起广泛的临床症状，包括发热、疲劳、头痛、皮疹、关节痛和肌痛。CRS是第一次输注CAR-T细胞后几天内发生的最常见的不良反应（85%的患者出现任何级别的CRS）。严重CRS病例以心动过速、低血压、肺水肿、心功能不全、高热、缺氧、肾损害、肝衰竭、凝血障碍和不可逆器官损害为特征。幸运的是，CRS的作用可以通过减少输注T细胞的数量和/或通过服用抗IL-6受体单克隆抗体和类固醇来缓解。

NTX是CAR-T细胞免疫治疗的另一常见并发症，发生在40%以上的患者中。通常出现在CAR-T细胞输注后的1至3周内，通常与CRS相关。患者表现出各种症状，如困惑、迟钝、震颤、谵妄、找词困难和头痛；其他症状，如失语症、颅神经异常和癫痫也有报道。

及时管理毒性对于降低与免疫治疗相关的死亡率至关重要，因此，研究人员制定了不同的安全策略来克服和预防CAR-T细胞毒性，如设计新一代的CAR。毒性管理已成为CAR-T细胞免疫治疗成功的关键步骤。

CAR-T细胞耗竭

尽管CAR-T细胞治疗完全缓解率高，然而大部分获得缓解的患者在几年内表现出疾病复发，B-ALL的复发率从21%到45%不等，并随着随访时间的延长而增加。治疗失败的部分原因是实体瘤产生的TME导致的CAR-T细胞耗竭。

CAR-T细胞耗竭是指一种功能障碍状态，其特征是由于持续的抗原刺激、CAR结构的共刺激域和抑制性受体的表达增加而导致抗原特异性T细胞的缺失。体外CAR-T细胞研究表明，在CAR-T细胞耗竭过程中，抑制性受体（如PD-1、Lag3、Tim3和TIGIT）的表达上调，以及通过CTLA-4抑制PI3K/AKT通路，是导致抗肿瘤功能丧失的主要原因。细胞因子在其中也起着重要作用，如耗竭的CAR-T细胞降低表达分泌IL-2、TNF-α和IFN-γ的能力此外。其他因素，如转录因子、代谢和表观遗传修饰，也在CAR-T细胞耗竭发展中发挥重要作用。

延迟耗竭的一种可能方法是构建抗耗竭的CAR-T细胞。最近的报告表明，某些转录因子如TOX和NR4A的发现，以及AP-1家族转录因子c-Jun的缺失或过度表达增加了CAR-T细胞对耗竭的抵抗力。最近，通过CAR-T细胞工程化（CRISPR/Cas9）敲除PD-1、或使用PD-1阻断抗体已被用于提高CAR-T治疗效果，避免耗竭。

肿瘤微环境

CAR T细胞免疫治疗在实体瘤中尚未取得成功。一个可能的原因是TME的免疫抑制性质影响过继免疫治疗的疗效。实体瘤存在高度浸润间质细胞，如癌相关成纤维细胞（CAF）和抑制性免疫细胞，包括髓源性抑制细胞（MDSCs）、肿瘤相关巨噬细胞（TAM）、肿瘤相关中性粒细胞（TAN）、肥大细胞，和调节性T细胞（Treg），它们有助于建立一种免疫抑制性TME，能够干扰CAR-T细胞疗法的疗效。

克服TME效应的策略包括使T细胞能够抵抗TME中的肿瘤抑制，例如显性负性受体或信号转换器的转基因表达，其可以将抑制信号转化为刺激信号。克服CAR-T细胞持续存在和耗竭的另一个机会是改善药物向肿瘤部位的转运。对于CAR-T细胞，局部注射是正在进行的一种尝试。

基因改变

一些报告显示使用CAR-T细胞治疗的患者缺乏疗效和复发存在基因改变。Orlando等人整合了全外显子组DNA-seq和RNA-seq，以研究CD19突变导致复发的程度。他们在12例患者样本中均发现了CD19基因第2–5外显子的新发基因改变，9例患者中的8例出现杂合性缺失，结论是CD19纯合子突变是获得性抗CAR-T细胞治疗的主要原因。

Asnani等人报告了类似的发现，他们描述了CAR-T细胞治疗后复发白血病患者外显子2和外显子5-6的跳跃。外显子2对CAR-T CD19表位的完整性至关重要，而外显子5-6负责CD19跨膜结构域。然而，需要进一步的研究来探索基因组分析的影响。

CAR-T细胞的制造工艺挑战

制造CAR-T细胞的传统技术包括：1）通过单采分离患者的T细胞（自体）；2）将回收的细胞运送到一个中心生产基地；3）对其进行基因改造以表达CAR；4）在实验室中进行扩增；5）将CAR-T细胞送回医院，注入患者体内。

这种使用自体CAR-T细胞的传统制造和治疗所涉及的物流增加了临床医生和患者的复杂性，如今，这种疗法带来了一些些主要的制造业挑战，其中包括：

CAR-T细胞的包装、运输和储存

CAR-T细胞的临床制造目前是一个复杂的过程，涉及多个步骤，跨越不同的地理位置，采用多种技术和物流。任何时间、运输方法、冷链或储存方面的错误都会导致细胞损伤，直接影响治疗效率，因此每一个步骤都需要仔细管理、精确的样本跟踪和足够的保存技术来冷冻患者样本。在整个CAR-T细胞制造过程中，需要不同温度的不同运输，因此，在生产过程中进行的低温保存必须保证质量控制。

良好制造规范（GMP）

CAR-T细胞是一项复杂的制备过程，cGMP是CAR-T细胞生产的关键和瓶颈。cGMP的目的是提供一个框架，确保训练有素和定期培训的员工在良好控制的设施和设备中进行高质量生产。同样，它提供了涵盖所有运营方面的严格文件流程，以证明持续和充分的合规性。

根据国际标准化组织（ISO）， CAR-T细胞制造需要GMP设施作为细胞处理洁净室，必须配备1）设施系统（如空气处理器、24/7报警监控系统）；2）环境监测设备（如粒子计数器）；3） 制造工艺设备（如细胞清洗机、生物反应器）；4）分析设备（如自动细胞计数器、流式细胞仪）。

维持符合GMP要求的生产环境的另一个关键因素是高技能员工，他们对GMP生产、质量控制和质量保证应具备广泛的知识。

慢病毒载体（LV）的制备

LVs的生产面临诸多挑战，例如其固有的细胞毒性、低稳定性以及对瞬时转染影响的依赖性，此外，上游和下游过程的产量低且成本高效益低。这部分已成功的商业化产品部分是建立了标准化和稳定的细胞系，以产生促进GMP合规过程的LVs，从而可以提供更容易的放大、再现性、生物安全性和成本效益。

工作人员和培训

考虑到治疗的复杂性及其相关的高风险副作用，CAR-T细胞的使用受到高度管制，只能在认证中心使用，并由训练有素的工作人员管理。所有参与CAR-T细胞制造的员工（从T细胞收集到制造商，再到临床单位）都需要经过广泛的培训，具备令人满意的能力水平。这种能力能够管理过程中可能出现的复杂情况，从而能够交付产品。

如今，在这个领域只有少数具备资格的专业人员，需要多学科协作和交流来创造这一领域的更多知识，学术参与也是一个重要方面。

质量控制

作为一种活的“药物”，CAR-T细胞具有复杂的制备过程，需要“全过程质量控制”。在生产过程中，良好控制的冷链运输和储存在确保细胞产品质量和防止细菌和支原体污染方面发挥着重要作用。CAR-T细胞质量控制的要求包括检查体外转导的T细胞是否存在病毒复制和生产材料残留。

此外，考虑到CAR-T细胞作为生物产品、细胞产品和基因治疗产品的特性，还应包括成品的放行试验，以确认其特性、纯度、安全性和效力。

此外，还需要进行稳定性研究，以验证储存条件及其保质期。CAR-T细胞的产生需要更深入的研究，以评估复发和回输患者的T细胞质量。这些研究应提供有关淋巴细胞群分布的数据。总之，质量控制对于CAR-T治疗的成功至关重要。

生产放大

CAR-T细胞的制造应具有可扩展性（即，为每位患者配备多个单一生物反应器），以便在不牺牲产品质量和可重复性的情况下，扩大惠及患者的范围。个性化治疗（如自体细胞治疗）不像普通生物制药那样只是增加体积，而是需要更精细的放大，即拥有多个生物反应器来放大每个患者的CAR-T细胞。此外，这取决于平行实现多个独立产品的能力。

制造时间和重复给药

CAR-T细胞的制造可能需要长达4周的时间，在这段时间内，患者极易遭受疾病进展和死亡的风险。此外，CAR-T细胞制造不允许体积放大，因此，细胞必须作为单个批次制备，限制了可用产品的数量。在这种情况下，患者可能没有机会快速、方便地接受新的CAR-T细胞输注。 

定价和可及性

定价和患者可及性是在全世界普及CAR-T细胞使用的最主要限制。目前的CAR-T细胞制造模式高度集中，且每个步骤的过程都很复杂，导致每次治疗的费用高达37.3万美元至47.5万美元（与治疗相关的医院费用不计入此类平均费用），患者和医疗系统都负担不起。

这一令人望而却步的成本限制了患者获得治疗的机会，尤其在社会经济不发达的国家无法持续，这进一步限制了CAR-T细胞疗法的广泛应用。在CAR-T细胞疗法变得经济实惠之前，其治疗潜力将无法真正得到实现。

法规要求

细胞产品的另一个重要瓶颈是监管。CAR-T细胞在全球范围内被视为高级治疗药物产品（ATMP），这些产品需要许可证。监管机构与标准疗法高度相关，但细胞产品有特殊要求。美国或欧盟监管机构正在努力定义最佳指南，以在全球范围内协调ATMP临床制造的要求。与此同时，不发达国家面临着更大的挑战，因为CAR-T疗法在临床中的使用受到极大限制，导致当局对监管要求缺乏了解。

增强CAR-T细胞技术使用的策略

新生物标志物的发现

生物标记物对于癌症临床治疗具有重要意义，它们可以用来确定适合CAR-T治疗的患者、预后、治疗反应预测和监测疾病进展。CAR-T治疗的第一个生物标志物是CD19，一种主要在恶性B细胞上表达的B细胞表面蛋白。

目前，正在根据免疫治疗的阶段寻找不同的生物标志物，包括确定患者基线状态的生物标志物、CAR-T细胞功能、CAR-T细胞耗竭、CAR-T细胞毒性的生物标志物以及癌症预后、反应和复发的生物标志物。基线生物标记物包括细胞因子，如IL-2、IL-5、IL-7、TNF-a等；乳酸脱氢酶（LDH）和CD9细胞已被广泛应用。对于CAR-T细胞功能，提出了以下生物标记物：CD45RA、CD45RO、CD62L、CCR7、CD27、CD28、CD25、CD127、CD57和CD137。目前，还没有成熟的生物标志物可用于评估患者输注后的CAR-T细胞耗竭。一些间接参数可能有助于实现这一目的，如PD-1、LAG-3、TIM-3等抑制性受体的高水平表达。

尽管CAR-T治疗取得了重大进展，但仍有必要继续探索不同的癌细胞类型特异性生物标记物，以开发更特异的治疗方法。

异基因CAR-T细胞

目前，大多数CAR-T细胞免疫治疗是使用自体T细胞产生的。这在不同层面上表现出若干不利因素，如生产过程可能耗时长且复杂，导致成本增加，此外，由于使用患者来源的T细胞进行CAR治疗，面临的挑战包括CAR-T细胞增殖较弱、扩增有限和持续性差。

改善这些问题的一个机会是使用同种异体CAR-T细胞，从而减少自体细胞生产的时间延迟。此外，从异基因健康捐赠者中产生通用的CAR-T细胞更容易获得，质量更高。这对于需要紧急治疗的侵袭性癌症患者非常重要。该策略将扩大可接受该免疫疗法的患者数量，使CAR-T细胞疗法成为一种现成的治疗方法，成本低廉，易于获得，并将提高T细胞的质量特性。

通用CAR-T细胞也面临一些挑战和问题。例如，供体和受体之间的免疫不匹配，如果受试者的异基因T细胞攻击健康受体组织，可能导致危及生命的移植物抗宿主病（GVHD），如果受试者的免疫系统识别异基因T细胞并对其作出反应，这些细胞可能会被宿主免疫系统迅速消除。一种可能的解决方案是通过基因敲除或破坏供体上的TCR基因和/或HLA I类基因座来消除GVHD。

与CAR-T细胞相比，CAR-NK细胞提供了更多的优势，例如在自体环境中降低细胞因子释放综合征和神经毒性；通过IPSC的使用可以提供了无限量的“现成”NK细胞，对恶性细胞具有快速反应，而不会引起GVHDs；另一个有利点是激活细胞毒性活性的多种机制（NKG2D、KIR、CD16、NKp30、NKp44、NKp46），仍然保持其靶向实体瘤和耐药肿瘤微环境的渗透能力。CAR-NK临床前研究表明，其对血液系统恶性肿瘤靶点（CD19和CD20）以及实体肿瘤靶点有效，证明其具有异基因治疗的潜力。

改善CAR-T细胞治疗的其他策略

双靶向或串联CARs，由两个单独的CARs在每个T细胞中的共表达组成，它们识别两种不同的抗原。一些双重CAR已进入针对CD19/CD20的血液系统恶性肿瘤和实体瘤的临床试验。HER2/MUC1双特异性CAR在乳腺癌模型的体外试验中具有良好的效果。双重CAR是解决抗原异质性和防止复发的一种非常有希望的方法。

此外，合成Notch（synNotch）受体已应用于CAR-T细胞以提高安全性。SynNotch受体识别一种特定的肿瘤抗原，然后释放转录激活域，促进CAR的局部表达。此外，synNotch调节的CAR表达可防止组成性信号传导和耗竭，使更高比例的T细胞处于幼稚/干细胞记忆状态。

抑制性嵌合抗原受体（iCAR）包含抑制性受体，如PD-1和CTLA-4，在减弱或终止T细胞反应中起着关键作用，因此，它们被认为是一种安全策略，使得T细胞能够区分靶细胞和非靶细胞。

此外，为了有效治疗实体瘤，疫苗、生物材料和溶瘤病毒等创新组合策略是很有前景的，因为它们可以直接增强T细胞的功能，或者招募内源性免疫细胞以及重塑TME。

全自动化制造过程

在世界范围内，需要CAR-T细胞免疫治疗的患者数量迅速增加，行业内已经开发了自动化和封闭式制造平台，以适应这种情况。这项工作的例子包括Cocoon®（Lonza）和CliniMACSProdigy（Miltenyi Biotec）的自动化平台，这两个平台都允许细胞的复制和快速生产，并且每个步骤都有严格的记录。2020年，Lonza和Sheba医疗中心宣布，首例患者在Sheba医疗中心接受了使用Lonza Cocoon平台制造的CD19 CAR-T细胞免疫治疗。

协作网络

由于高成本和技术的高要求，目前大多数患者仍无法负担得起CAR-T细胞治疗。为了实现CAR-T细胞的普及，有必要在学术界、工业界和医院等不同利益相关者之间建立一个协作网络，以便在应用这一技术的每个国家为这类产品制定充分而有力的立法。

因此，大学应该为未来的专业人士提供知识和创新，以便他们研究新的生物标记物发现、开发稳定的细胞系、开发新的验证产品质量的分析方法以及了解不同的生产系统。应用GMP、质量控制和自动化流程的行业可以支持建立更标准化、更可靠、质量更高的产品，还可以开发现场生产装置，降低运输和储存成本。医院必须有足够的设施来管理这项技术，配备现场生产单位管理方面经过培训的人员，以及有效治疗患者的医务人员和卫生专业人员。

包括所有这些活动，必须在这一领域制定强有力的具体立法，以保证这类高级治疗的质量。此外，监管是这一过程的重要组成部分。如今，关于不同国家监管指南的信息很少，EMA和FDA指南已经为这些技术建立了此类要求的基线，但临床试验不同阶段的行为和结果将涉及新的考量因素。

小结

药学的角度来看，CAR-T细胞被视为高级治疗产品，其质量必须通过其特性、安全性和有效性来证明。这三个方面中的每一个都面临了重大挑战。科学界以及工业界都需要继续努力，在临床方面，继续寻找新的生物标记物，改进CARs的开发，降低CRS和NTX的相关不良反应，以及CAR-T细胞在实体瘤中的应用，以提高该疗法的安全性和有效性。

在制造和工艺方面，需要成本更低的生产系统，生产的稳定性以及必要的质量要求，这些都是持续的挑战。此外，这些过程必须完全符合国际和国内监管部门制定的要求。

最后，需要各方面的专业人员在各个阶段的多学科参与。通过学术界、工业界、医院和政府在国际和地区层面的紧密合作，将有可能使更多的患者更广泛地受益于这项新型的技术。

参考文献：

1.Chimeric Antigen Receptor-TCells: A Pharmaceutical Scope. Front Pharmacol. 2021; 12: 720692.