Haematologica：APR-246 通过铁死亡诱导急性髓细胞白血病早期细胞死亡

急性髓性白血病 (AML) 是高度异质性的疾病，具有不断激活的致癌信号。APR-246 是一种很有前途的新型治疗药物，可以靶向治疗骨髓增生异常综合征和急性髓细胞白血病 (AML) 中的 p53 突变蛋白。APR-246 通过促进 p53 突变体与 DNA 靶位点的结合重新激活它们的转录活性。

近期对实体癌症的研究发现，APR-246也可以诱导p53无关的细胞死亡。在一项研究中，研究人员证明了APR-246暴露后早期发生的AML细胞死亡受到铁螯合剂、亲脂抗氧化剂和脂质过氧化抑制剂的抑制，并与脂质过氧化标记物的积累相关，因此符合最近描述的细胞死亡过程“铁中毒”的定义。

图 1： APR-246 在急性髓性白血病细胞中诱导细胞死亡，无论其TP53突变状态如何。(A) 所示细胞在 APR-246 处理后 24 小时 (h) 的活力曲线。误差线，±标准偏差。(B) APR-246 治疗后 24 小时指示的原发性急性髓性白血病 (AML) 细胞的活力曲线。在线补充表 S1中提供了患者特征。(C) APR-246 处理 24 小时的半最大抑制浓度百分比 (IC ₅₀ %) 在基于细胞活力 (n = 3) 的一组 AML 细胞系中。在我们随后的实验中，我们在这些浓度范围内选择了五种对 APR-246 敏感的 AML 细胞系，有或没有TP53突变（以粗体突出显示）。wt：野生型；fs：移码；del：删除。

图 2：APR-246 在急性髓系白血病细胞中诱导铁死亡。(A) 指定细胞在 APR-246 处理后 (60 mM) 后 16 小时 (h) 的细胞活力 (%)，有或没有 ferrostatin-1 (10 mM)、去铁胺 (DFO) (100 mM)、necrostatin- 1 (20 mM)、氯喹 (20 mM) 或 QVD-OPH (25 mM) (n=3)。误差线 ± 平均值的标准误差 [SEM]。在 APR-246 之前 2 小时 (h) 将所有化合物添加到培养基中。统计，2-way ANOVA；* P <0.05, ** P <0.01, *** P<0.0001。(B) 用二甲基亚砜 (DMSO)、APR-246 (60 μM) 或嘌呤霉素 (1 mg/mL) 处理 16 小时的 MOLM-14 细胞中 PARP、caspase 8 和 caspase 3 的免疫印迹分析。b-肌动蛋白用作上样对照（n = 2）。(C) 指示细胞在 APR-246 处理后 16 小时的活力曲线，有或没有 ferrostatin-1 (10 mM)、DFO (100 mM)、necrostatin-1 (20 mM)、氯喹 (20 mM) 或 QVD- OPH (25 毫米) (n = 3)。误差线±SEM。（ d ）在有或没有ferrostatin-1（10 mM）（n = 3）的APR-246处理（50 mM）后16小时和24小时，指定细胞的细胞死亡（％）。误差线±标准偏差。

图 3. APR-246 在急性髓细胞白血病细胞中诱导铁死亡。(A) 用或不用 APR-246 (60 mM, H16) 处理的 MOLM-14 细胞的电子显微镜分析。白色箭头表示线粒体显示膜破裂和减少的嵴。（B 和 C）在 APR-246 治疗后 14 小时使用 C11-BODIPY 和流式细胞术（FCM）检测急性髓性白血病（AML）细胞系（B）和原发性 AML 细胞（C）中的脂质过氧化。APR-246 用于 MOLM-14 的浓度为 100 mM，其他 AML 细胞系的浓度为 50 μM。左图显示了具有代表性的 FCM 量化 (n=3)。误差线±标准偏差。

图 4. APR-246 在急性髓性白血病细胞中诱导谷胱甘肽消耗。(A) 与铁死亡有关的细胞途径总结。铁死亡是由含多不饱和脂肪酸 (PUFA) 的磷脂 (PL-PUFA) 的铁催化过度过氧化引发的。谷胱甘肽 (GSH) 和谷胱甘肽过氧化物酶 4 (GPX4) 是控制脂质过氧化物消除的两个关键因素。溶质载体家族 7 成员 11 (SLC7A11) 编码名为系统 xc- 的异二聚胱氨酸-谷氨酸反转运蛋白的转运亚基。System xc- 介导胱氨酸进入细胞以换取谷氨酸。²⁶一旦进入细胞内，胱氨酸迅速还原为半胱氨酸，这是谷胱甘肽合成的限制性氨基酸。SLC7A11 抑制导致细胞内半胱氨酸耗尽，从而导致细胞内 GSH 库耗尽。GPX4 是一种多效性硒蛋白，它使用 GSH 选择性地将脂质氢过氧化物还原为脂质醇，以保护细胞免受膜脂质过氧化。²⁹GPX4 抑制是由于其直接抑制或下调，或通过直接或间接过程消耗 GSH。GPX4 的抑制导致不受控制的多不饱和脂肪酸磷脂 (PL-PUFA) 氧化和脂肪酸自由基的产生，导致细胞铁死亡。ACSL4：酰基辅酶A合成酶长链家族成员4；LPCAT 3：溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶 3；ALOX：花生四烯酸脂氧合酶；PUFA：多不饱和脂肪酸；PL：磷脂；PE：磷脂酰乙醇胺；GPX4：谷胱甘肽过氧化物酶 4。(B) 在 APR-246 和 fer1 (10 mM) 处理后 14 小时 (h) 通过流式细胞术 (FCM) 测量急性髓性白血病 (AML) 细胞系中的 GSH (mBCI)。APR-246 以 100 mM 用于 MOLM-14，50 mM 用于其他 AML 细胞系。Fer1 与防止细胞死亡和允许分析 GSH 消耗有关。左面板显示有代表性的 FCM 量化。n=3。误差线 + 标准偏差。统计数据t检验。* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.0001。(C 和 D) MOLM-14 在 APR-246 治疗后 24 小时 (60 mM) 的细胞死亡 (%) (C) 和 GSH (mBCI) 测量 (D) 有或没有 B-ME (50 mM),半胱氨酸 (50 mM) 或 Fer1 (10 mM)。误差线 + 标准偏差。通过t检验统计；* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.0001。

图 5： SLC7A11 过表达可防止 APR-246 暴露后的谷胱甘肽消耗和细胞死亡。(A) APR-246 (100 mM) 和 Fer1 (10 mM) 处理后 16 小时 (h) 在 MOLM-14 和 OCI-AML2 细胞系中的胱氨酸摄取。Fer1 与防止细胞死亡有关，并允许分析胱氨酸摄取。(B) 用二甲基亚砜 (DMSO) 或 APR-246 (n=2) 处理 16 小时的 MOLM-14 细胞中 SLC7A11 的免疫印迹分析。b-肌动蛋白用作上样对照。(C 和 D) APR-246 处理后 20 小时 (n = 3) 指定细胞的细胞死亡 (%) (C) 和谷胱甘肽 (GSH) (mBCI) 测量 (D)。对于 GSH 测量，Fer1 与防止细胞死亡和允许分析 GSH 消耗有关。误差线±标准偏差。通过t检验进行统计。* P<0.05，** P <0.01，*** P <0.0001。

图 6： SLC7A11 抑制使细胞对 APR-246 敏感。(A) MOLM-14 和 OCI-AML2 与小发夹 RNA 对照 (shSCR) 或强力霉素诱导型 shRNA (shSLC7A11) 细胞在 APR-246 处理后 16 小时 (h) 的活力曲线。在添加 APR-246 之前，用强力霉素 (n=3) 处理细胞 3 天。误差线 ± 标准偏差 (SD)。(B 和 C) APR-246 后 20 小时指定细胞的细胞死亡 (%) (B) 和谷胱甘肽 (GSH) (mBCI) 测量 (C) (MOLM-14 30 mM, OCI-AML2 10 mM)治疗（n = 3）。对于 GSH 测量，Fer1 与防止细胞死亡和允许分析 GSH 消耗有关。在添加 APR-246 之前，用强力霉素 (n=3) 处理细胞 3 天。误差线 ± SD。通过t检验进行统计。* P <0.05, ** P<0.01，*** P <0.0001。(D) APR-246 (MOLM-14 30 mM, OCI-AML2 10 μM) 和/或erastin (MOLM-14 100 nM, OCI-AML2 1 mM) 后 24 小时指定细胞类型的细胞死亡 (%)。误差线 ± SD。通过t检验统计；* P <0.05，** P <0.01。(E) MOLM-14 细胞与 APR-246 和erastin 24 小时共同处理的说明性协同图（左图）。使用三个独立实验的平均细胞活力。AML 细胞系与 APR-246 和 erastin (n=3) 共同处理 24 小时协同作用最强区域的平均协同得分。(F) 原发性 AML 细胞与 APR-246 和 erastin (n = 1) 共同治疗 48 小时的平均协同评分

暴露于APR-246后，AML细胞通过增加胱氨酸摄取来维持主要抗氧化分子谷胱甘肽的生物合成来解毒脂质过氧化物的能力可能是对这种化合物敏感性的关键决定因素。

总的来说，无论是在体内还是体外，APR-246与铁中毒诱导(通过药理学化合物，或SLC7A11或GPX4的遗传失活)都具有协同促进细胞死亡的作用。

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