Nat Commun：仅4个CpG甲基化位点即可识别肝癌患者，特异性100%，灵敏度98%

导读

肝细胞癌（HCC）是全球第五大常见癌症，在亚洲尤为普遍。在肝癌早期获得诊断的患者，其治愈率可高达80%，但临床上HCC几乎总是在晚期时才被诊断出来。目前的诊断方法，包括影像学和蛋白免疫测定，由于准确性低往往不能早期诊断HCC。

癌症的分子诊断主要关注肿瘤和起源于肿瘤的生物物质，包括血浆中的ctDNA、循环肿瘤细胞（CTC）和肿瘤-宿主微环境。但现存的这些方法也都有其技术局限性，例如外周循环中ctDNA的数量少且多变，并且需要一种足够准确的方法来区分肿瘤DNA与血浆中其他来源的cfDNA。

为了解决上述挑战，香港精准医学技术有限公司（HKG Epitherapeutics Ltd.）与加拿大、孟加拉国的临床医生和研究团队合作在Nature Communications发表了题为“A high-throughput test enables specific detection of hepatocellular carcinoma”的文章。研究论证了高通量DNA甲基化测序方法的可行性，这种方法可以用少量血液对少量的CpG位点进行检测，以便对HCC患者进行分类。研究显示，该高通量DNA甲基化测序方法可通过独特的DNA甲基化特征识别早期HCC，并有可能彻底改变高危人群的HCC早期检测，从而降低与肝癌相关的发病率和死亡率，提高患者预后。

文章发表在Nature Communications

主要研究内容

“HCC-detect”的发现与验证

研究人员使用TCGA和GEO数据存储库集合中的12525个甲基化谱描述了在被分析组织和血液样本中始终未甲基化的DNA甲基化位置。这些 “抗甲基化”位点在CpG岛、转录起始位点中高度富集。值得注意的是，许多这些无处不在的甲基化抗性CpG在HCC发现队列中发生甲基化，在包括肝硬化在内的非HCC肝脏样本中没有被甲基化。

随后，研究人员列出了4个足以对正常组织和血细胞混合物中的HCC进行分类的CpG位点，并将其称为“HCC-detect”，并在由700多个HCC样本的DNA甲基化谱组成的数据集中验证了由这些位点的甲基化评分。加权多基因甲基化评分也能够显著区分HCC和非HCC对照样本。

研究团队使用DNA甲基化450 K阵列数据对739例HCC、116例邻近非肿瘤组织（NATs）、16例健康肝脏和968例血液样本进行了“HCC-detect”验证，对公开数据中的11718个样本计算了“HCC-detect”评分。ROC分析显示出优异的生物标志物特性；HCC与健康血液的AUC为0.99（图1F），HCC与包括肝脏在内的所有健康和NAT组织的AUC为0.97（图1G），HCC样本与健康组织的AUC为0.95（特异性95%；与NAT相比，HCC的AUC为0.92（特异性94%；敏感性95%），HCC与健康肝组织的AUC为0.966（特异性100%；敏感性88%），与31种不同类型的癌症相比，HCC的AUC为0.87。“HCC-detect”甲基化评分可以检测早期HCC样本和晚期HCC样本。

图1. “HCC-detect”的发现与验证，来源：Nature Communications

“HCC-spec”的发现与验证

研究团队使用来自TCGA的230个随机选择DNA甲基化样本，包括17种不同的癌症，10个HCC样本和10个健康血液样本，筛选出了7个区分HCC和其他肿瘤来源的CpGs，其中F12基因上的cg14126493影响最大，命名为“HCC-spec”。通过线性回归方程计算的“HCC-spec”加权甲基化评分正确分类了训练队列中240个样本中的所有HCC样本。ROC曲线（HCC与所有其他样本）显示AUC为0.9973，敏感性为99%，特异性为100%。

研究团队通过对包含31种不同肿瘤、非恶性组织和HCC样本混合物中的HCC DNA进行分类，验证了“HCC-spec”。“HCC-spec”评分在HCC与健康血液、健康组织、邻近非肿瘤组织（NATs）和其他癌症之间存在显著差异，但在HCC与健康肝组织和肝病样本之间无显著差异（图2E）。HCC与所有其他癌症的AUC为0.988（图2F），与正常血液的AUC为0.981（图2G），与健康组织的AUC为1。与非恶性肝脏DNA相比，HCC的AUC要低得多；健康肝组织的特异性为86%（特异性100%；敏感性73%），肝脏疾病组织为0.84（特异性95%；敏感性71%）。

图2. “HCC-spec”的发现与验证，来源：Nature Communications

与肝硬化和正常肝脏的数据相比，“HCC-detect”和“HCC-spec”中包含的基因在具有HCC ctDNA和肿瘤样本的不同验证集中的甲基化水平存在显著差异。但由于血清样本中reads数较少，在血浆中未达到统计学显著性。

图3. “HCC-spec”和“HCC-detect”在GSE63775数据集中的验证，来源：Nature Communications

此外，研究人员还将“HCC-spec”和“HCC-detect”DNA甲基化标记物与近期报道其他有希望的HCC生物标记物进行了比较。结果显示，虽然此前发表的标记物在HCC和HCC-NAT样本之间存在显著的甲基化差异，但在其他癌症和正常组织中存在高背景的DNA甲基化；而在这项研究中描述的“HCC-detect”和“HCC-spec”联合标记了HCC中高甲基化与其他组织和大多数癌症中显著低甲基化之间的分类。

图4. “HCC-spec/-detect”与其他生物标记物的比较，来源：Nature Communications

“HCC-detect”和“HCC-spec”在临床研究中的验证

上述研究结果表明，HCC患者血浆cfDNA的甲基化模式与健康人或慢性乙型肝炎患者血浆cfDNA的甲基化模式不同，HCC患者的甲基化水平明显高于健康人和非HCC癌症患者。在对照组和慢性乙型肝炎患者中，甲基化中位数略高于0%，HCC样本的甲基化水平处于50%至80%之间。

“HCC-detect”和“HCC-spec”M评分也可将HCC组与健康对照组或慢性乙型肝炎组显著区分开来，但慢性乙型肝炎（CHB）与两种健康对照组之间没有显著差异。重要的是，HCC早期和晚期的“HCC-detect”M评分和“HCC-spec”M评分均与对照组和慢性乙型肝炎组有显著差异，但HCC分期之间无显著差异。

图5. “HCC-detect”和“HCC-spec”在血浆样本中的验证，来源：Nature Communications

研究团队将“HCC-spec”和“HCC-detect”的整合称为“epiLiver”。epiLiver检测可对公共数据库中的HCC样本进行分类，且准确率很高。研究人员计算了46名健康对照和302名HCC患者的epiLiver检测的ROC曲线，AUC为0.94，特异度为95%，灵敏度为84%。但每个HCC分期的中位数评分彼此之间没有差异。研究人员从AUC曲线中计算阈值和概率，并使用它将样本分类为HCC或非HCC，该阈值准确分类了93.5%的对照样本。

图6. 基于“HCC-detect”和“HCC-spec”对HCC进行分类，来源：Nature Communications

结语

综上所述，研究团队展示了一种可行且准确的HCC无创检测方法，通过分析液体活检中HCC的DNA甲基化特征，发现其与正常组织和血液特征不同。基于此，研究人员开发了一个基于四个CpG位点的分类器，发现仅这4个CpG位点的甲基化就能以100%的特异性识别98%的HCC样本。虽然并非所有HCC样本的4个位点都甲基化，但98%的样本至少有一个CpG甲基化。研究团队建议将这4个CpG位点作为“HCC-detect”标记物，并在TCGA HCC数据中得到验证。重要的是，这些标志物可以区分HCC与其他肝脏疾病，包括肝硬化和慢性乙型肝炎。此外，在TCGA和GEO数据库中，单个F12基因CpG位点可以有效地将HCC样本与其他血液样本、正常组织和非HCC肿瘤区分开来。这些标记物在来自HCC患者和对照组的单独血浆样本数据集中得到了验证。

基于上述结果，研究人员设计了一种基于种靶向多路高通量下一代亚硫酸盐测序的epiLiver检测方法，分析了554名临床研究参与者的血浆样本，包括HCC患者、非HCC癌症患者、慢性乙型肝炎患者和健康对照者。该方法可对HCC患者进行分类，灵敏度为84.5%，特异性为95%，AUC为0.94。研究团队认为，对高危人群实施这种检测可以显著降低HCC的发病率和死亡率，有助于减轻HCC对个人和卫生系统的负担。

参考资料：

Cheishvili, D., Wong, C., Karim, M.M. et al. A high-throughput test enables specific detection of hepatocellular carcinoma. Nat Commun 14, 3306 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39055-7