韩春雨诺奖级结果再次被验证 -- 仇子龙确认重复出实验结果

上次国外一教授重复出韩春雨成果，见：更新：研究者成功重复韩春雨 NgAgo 方法，现在国内上海生命科学研究院仇子龙教授再次确认重复出结果。

河北科大副教授（据闻已突击评为正教授）韩春雨因发明基因编辑新技术，被称为“诺贝尔级成果”，一夜成名，号称“诺公招手”了（注）。但是有多家实验室反映重复不出其论文中最关键的图4结果。有人仔细研究图4图片，发现其电泳结果不合理；还有人对这些图片做了亮度、对比度处理，发现有拼接的痕迹。这是怎么回事呢？

多说无益，上图为证，公道自在人心！

图片来源于新媒体

方舟子部分原文

我当然不怕被人肉，也不怕挨骂，所以在此问几个问题：

第一，有没有人重复出了韩春雨论文中的图4结果？有的话跟我说一下。

第二，据称韩春雨在遗传所的报告上说，重复出来和不能重复的比例是1：3，能重复出来的有20家。那么究竟有哪家实验室重复出来了？（指图4结果）这事没必要保密吧。

第三，韩春雨说做这个实验“需要高超的实验技巧”，那么究竟在哪个步骤需要什么样的高超实验技巧？

为什么一个新实验的结果别人都反映重复不出来，原因很多，比如可能是重复出来的都不吭声，重复不出来的实验技术不行，论文中隐瞒了关键的“实验技巧”（这不道德），或者论文报告的结果干脆就是编的（这更不道德）。一个新的科学发现、技术，需要经过别人的重复才得到公认。别人重复不出来，有疑问，是很正常的。

作为首创者应该做的是去消除疑问，而不是攻击、谩骂，否则那更让人怀疑。

质疑一图片3

有人能重复（FACS和Western Blot），但那有可能是假阳性。

在图片3中，研究人员在哺乳动物细胞中比较了NgAgo-gDNA系统和Cas9-sgRNA系统的编辑效率，发现NgAgo-gDNA系统让靶基因失活的效率与Cas9-sgRNA系统一样高。利用这种方法，他们还证实对NgAgo而言，单链gDNA的最佳长度是24个核苷酸左右。

质疑二图片4

目前还未见有人反映重复出了图4结果。

图片4中，设计了针对人DYRK1A基因的gDNAs，以及另外的八个不同基因的47条guides，效果均不错，作者还在乳腺癌细胞系MCF-7、人骨髓细胞系K562和HeLa细胞系在内的多种哺乳动物细胞系中测试了NgAgo-gDNA系统，结果发现在所有这些细胞系中，NgAgo都能够高效地诱导DYRK1A基因靶位点发生双链断裂，证明了其广泛的基因组靶向范围。

同时，作者也设计实验证明NgAgo介导的靶DNA切割对这个gDNA每个位置上的单核苷酸错配非常敏感：切割效率下降了73%～100%，其中P8～P11位置上发生的单核苷酸错配导致最大的切割效率下降（85%~100%），他们还发现任何3个连续位置发生错配会完全破坏这种切割，这些实验初步地证实NgAgo-gDNA系统是高度保真的。

韩春雨老师的回复

槐北路证实是韩老师在百度贴吧的账号。（图片来源于网络）

质疑一图片3

有人能重复（FACS和Western Blot），但那有可能是假阳性。

韩春雨的回复：细胞做好检测，不要有寄生菌污染，不要有支原体污染（Ago系统对污染特别敏感——特别是单转guide假阳性——我非常确定在没有污染的情况下，单转guid不会影响GFP表达，假阴性也大多因为细胞污染，假阳性和假阴性我都遇到过，国内买的细胞我就不吐槽了），转染用的质粒质量要好（可用30ngGFP转细胞，若是均一且效率高表明质量好，强弱不均一则表明质量差，越不均一表明质量越差），guide磷酸化完全（没有磷酸化不能load和切割——谢谢印证我的Fig2结果，至于怎么检测，自己跑个PAGE看看……）。

质疑二图片4

目前还未见有人反映重复出了图4结果。

韩春雨的回复：Fig4，也是几乎惟一算是有难度的，就是控制转染时的细胞密度和用血清控制细胞生长，时间稍长，毕竟NgAgo未经过系统的密码子优化——照着online method上protocol for genome editing and T7E1做（小经验，PCR最好不要有引物二聚体，如果引物二聚体多请重设引物；PCR产物直接回收最好不跑胶回收，可能跟ago切24bp有关，设好对照！）银染分辨率高，可以排除T7E1假阳性，能做出预期条带后请用PCR产物去测序。欢迎大家广泛使用此系统，并分享成功经验和失败教训。附，addgen上的质粒，可以直接用作基因组编辑。再次强调，不加NgAgo，就能抑制GFP，是假阳性，是细胞出问题了（谢天谢地不但我自己而且审稿人也有这个对照）出现假阳性的细胞切基因组就没戏了。对于Fig4，若是不习惯做银染，也可以直接做KI：doner 用GFPcoden+polyA signal，前后加几个保护性的碱基——从GFP-N1扩出来连到T-vector上，再从此doner-Tvector上扩（防止GFP-N1污染的假阳性）出来纯化，500-800ng共转（for each well of 24 well plate）。

真相只有一个，浪淘沙，吹落黄沙始到金！

上海神经所仇子龙实验室可以重复出韩春雨的工作：

仇子龙自己确认的，并且同意公开确认可以重复出韩春雨的工作。

图片来源于网络

仇子龙博士

1994-1998年就读于上海交通大学生物科学与技术系，获学士学位。

1998-2003年就读于中国科学院上海生命科学院生物化学与细胞生物学研究所，获博士学位。

2003-2009年在美国加州大学圣迭戈分校神经生物学系从事博士后研究工作。

2009年受聘于中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究所任研究员，课题组长。

代表性论文

1. Qiu, Z., Sylwestrak, E., Ghosh, A., The Rett syndrome protein MeCP2 regulates synaptic scaling. (Submitted)

2. Qiu, Z., and Ghosh, A. (2008). A Calcium-dependent switch in a CREST-BRG1 complex regulates activity-dependent gene expression. Neuron 60: 775-787. (Highlighted in Molecular Biology Select of Leading Edge section on Cell at Jan. 29. 2009)

3. Qiu, Z., and Ghosh, A. (2008). A brief history of neuronal gene regulation: regulatory mechanisms and cellular consequences. Neuron 60: 449-455. (Invited review)

4. Kashani, A. H., Qiu, Z., Jurata, L., Lee, S. K., Pfaff, S., Goebbels, S., Nave, K. A., and Ghosh, A. (2006). Calcium activation of the LMO4 transcription complex and its role in the patterning of thalamocortical connections. J. Neurosci. 26: 8398-8408.

5. Qiu, Z., Wei, Y., Chen, N., Jiang, M., Wu, J., and Liao, K. (2001). DNA synthesis and mitotic clonal expansion is not a required step for 3T3-L1 preadipocyte differentiation into adipocytes. J. Biol. Chem. 276: 11988-1199

让子弹飞一会，经得起检验，耐得住推敲！

更新消息：仇子龙教授称仅重复出前面少部分研究，后面结果依旧等待确认！