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**肺癌全自动免疫组化伴随诊断试剂盒在华获批上市

2013-11-13 佚名 dxy

有效识别ALK蛋白表达 实现肺癌患者个体化治疗肺癌是全球排名第一位的肿瘤杀手。与30年前相比,我国肺癌死亡率上升了465%[ Tian Xiao, Lei Bao, Hongbin Ji, Finding biomarkers for non-small cell lung cancer diagnosis and prognosis Frontiers in Biology, Februar

有效识别ALK蛋白表达 实现肺癌患者个体化治疗

肺癌是全球排名第一位的肿瘤杀手。与30年前相比,我国肺癌死亡率上升了465%[ Tian Xiao, Lei Bao, Hongbin Ji, Finding biomarkers for non-small cell lung cancer diagnosis and prognosis Frontiers in Biology, February 2012, Volume 7, Issue 1, pp 14-23],发病率高居榜首。肺癌通常分为非小细胞肺癌(Non-small-cell carcinoma,NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)。其中NSCLC占了肺癌的85%。

随着肿瘤分子生物学的进展,临床上对NSCLC的认识正不断深入。研究表明,50% NSCLC的发生是由于一系列的驱动基因,包括EGFR,KRAS,ALK,MEK,PI3K,BRAF等。找到驱动基因,再进行针对性用药,NSCLC治疗就能事半功倍。研究人员发现,胰岛素受体家族的成员——间变性淋巴瘤激酶(ALK)是NSCLC的关键启动癌基因。在NSCLC患者中,虽然只有5%[Soda M, Choi YL, Enomoto M, et al. Identification of the transforming EML4-ALK fusion gene in non-small-cell lung cancer. Nature, 2007, 448(7153): 561-566.] [ Wong DW, Leung EL, So KK, et al. The EML4-ALK fusion gene is involved in various histologic types of lung cancers from nonsmokers with wild-type EGFR and KRAS. Cancer, 2009, 115(8): 1723-1733.] [ Shaw AT, Yeap BY, Mino-Kenudson M, et al. Clinical features and outcome of patients with non- small-cell lung cancer who harbor EML4-ALK. J Clin Oncol, 2009, 27(26): 4247-4253.]的患者会出现ALK基因重排,但是中国每年新发病例数仍接近35,000例[全国肿瘤防治办公室/全国肿瘤登记中心/卫生部疾病预防控制局,2009全国肿瘤登记年报,北京:军事医学科学出版社,2010]。由于ALK阳性NSCLC具有明确的分子靶点、靶点检测技术以及上市的靶向药物,通过准确诊断ALK基因重排, ALK阳性患者可从酪氨酸激酶抑制剂(克唑替尼)治疗中获益,明显提高临床疗效。

从组织学分型上,还有肺腺癌和肺鳞癌之分。由美国病理协会、国际肺癌研究协会、分子病理协会出台的《肺癌分子标志物检测指南2013》明确指出:所有含有腺癌成分的NSCLC均需检测ALK。今年6月,由中国临床肿瘤学会肿瘤生物标志物专家委员会出台的《中国间变性淋巴瘤激酶(ALK)阳性非小细胞肺癌诊断专家共识(2013版)》(简称《共识》)指出:对于潜在怀疑存在ALK基因融合变异的患者均可进行ALK融合基因检测。

在第七届中国病理医师年会期间,罗氏诊断举办了“ALK在NSCLC中的诊断与经验分享”卫星会,全国知名病理专家就ALK检测方法、最新标准化的ALK免疫组化检测判读指南等内容进行了探讨。

ALK融合基因的检测方法

根据《共识》,荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization, FISH)、基于PCR扩增基础上的技术和免疫组织化学法(immunohistochemistry, IHC)均可作为针对ALK融合基因检测常用的方法,实验室可以根据组织标本类型选择合适的检测技术。

由于大部分克唑替尼治疗ALK阳性NSCLC的临床试验均是基于FISH的诊断,因此,FISH检测目前仍是确定ALK融合基因的参考标准方法。但是,由于FISH检测对于操作和判读技术的要求很高,只有FISH操作经验丰富的医师判定的结果才具有可靠性;而且晚期NSCLC患者通常只能提供2mm左右的小活检组织,因此很难保证每个视野存在50个以上的癌细胞供结果判读;而且暗视野下无法获得完整的组织形态学结构。FISH检测结果要求≥15%的判断界值(cut off)也存在商榷之处,研究结果显示少数ALK FISH检测阴性、IHC检测阳性的患者也能从靶向药物中获益。同时,目前FISH检测的成本昂贵,且不能明确ALK融合基因的具体融合变体。因此,在现阶段,FISH检测尚无法适用于中国ALK阳性NSCLC患者的大规模筛查和诊断。

基于PCR扩增基础上的RT-PCR法检测ALK融合基因的特点在于快速、简便易行,能同时明确ALK基因已知的融合变体的类型。但是,该方法对于RNA提取的质量要求较高,国内部分实验室未具备严格的质量控制条件。此外,无法检测未知的融合型是其最大的不足之处,限制了其在ALK诊断中的应用。

早期的ALK融合蛋白的IHC抗体敏感性较低,因此不适宜用于ALK融合蛋白的检测。随着技术的改进, 罗氏诊断VENTANA ALK IHC检测特异性的提高了检测灵敏度,同时采用全自动化操作,使检验流程和结果判读都得以标准化,可实现与FISH结果高度一致性,结果判读的可重复性为99.7%,为ALK检测的临床广泛应用带来了巨大的突破。




首款全自动IHC检测获认可

VENTANA ALK IHC检测是唯一获得欧盟认证的用于识别适合克唑替尼治疗的患者的体外诊断IHC检测,已在全球超过53个国家销售。日前,该检测获得了中国国家食品药品监督管理总局(CFDA)批准在华上市。该项批准基于一项囊括了北京肿瘤医院、中国医学科学院肿瘤医院、复旦大学附属肿瘤医院的1,100个中国患者的回顾性研究,证明了VENTANA ALK IHC检测与雅培Vysis ALK Break Apart FISH 探针试剂盒的一致性达99.23%。

VENTANA ALK IHC技术平台方法使用了基于非内源性半抗原、信号扩增多聚体和辣根过氧化物酶系统的染色信号放大技术。在不影响检测特异性的前提下,提高了敏感性。结果判读时采用二分类系统,即仅为阳性和阴性两种,阳性结果即可诊断为ALK阳性NSCLC。

来自复旦大学附属肿瘤医院的免疫组化病例证实,VENTANA ALK IHC检测具有独特优势。判读标准简单;敏感性高,均为强阳性颗粒,不用判断强度和百分比;全自动检测有效避免操作流程中的误差,可重复性好;可检测FFPE的细胞学样本、细针穿刺、支气管活检以及大体样品, 没有最低细胞数要求。最重要的是,价格便宜,可同时用于ALK的筛选和诊断。

在进行VENTANA ALK IHC检测时,建议检测人员使用10%的中性福尔马林和锌福尔马林固定后,用石蜡包埋组织样品,时间应不少于6小时,但不要超过24个小时;为了避免严重影响染色结果,应避免使用AFA、B5、Bouin’s或95%酒精固定。建议使用保存不超过3个月、厚度约为4微米的切片,使用正电荷载玻片。





鉴于ALK基因重排或融合的分子诊断各种方法均有优缺点,且我国适用于ALK变异检测的肺癌患者人数众多,《共识》中提出一套行之有效的分子诊断流程(见图3),并认为IHC具有方便、易行、价格低的优势,适合于ALK阳性NSCLC的筛查。FISH和RT-PCR由于结果判读客观,且qRT-PCR已获CFDA批准用于临床检测,适合于最终的确诊。

《共识》专家组推荐ALK基因状态检测的总体原则:应综合肺癌获取的各类生物材料的特征、分子检测方法的特点、实验室自身条件,进行多学科大协作,合理采取有效检测方法和流程,以保证ALK阳性肺癌的检出率和准确率。




注:(1)a:建议优先在以下临床病理特征集中的患者标本中进行筛选:粘液型腺癌、含印戒细胞成分、不吸烟、年龄<60岁,但这些特征并非排他性的,即对其他疑有ALK融合变异患者均可进行检测;(2)b:对于部分无条件行VENTANA IHC检测的医疗机构或中心,常规ALK IHC可作为替代筛选方法,但阳性标本需以FISH、VENTANA IHC或序列特异性的PCR技术进一步确诊(3)ALK抗体使用推荐:VENTANA IHC使用专用抗体试剂盒(D5F3);(4)流程图中FISH、RT-PCR、VENTANA IHC技术之间的虚线表示:单一技术检测结果判断不确定时3种方法之间可相互验证结果;(5)c:序列特异性的PCR技术诊断ALK融合基因条件:PCR产物经测序后序列比对确认或基于特异性荧光探针的即时定量PCR检测融合变异,单纯RT-PCR产物经电泳后的条带观察不推荐作为ALK融合基因诊断依据;(6)请参考2013年度美国病理学家学会(CAP)、国际肺癌研究协会(IASLC)、分子病理学协会(AMP)联合发布的《肺癌患者使用靶向药物的分子检测指南》[ Lindeman NI, Cagle PT, Beasley MB, et al. Molecular testing guideline for selection of lung cancer patients for EGFR and ALK tyrosine kinase inhibitors: guideline from the College of American Pathologists, International Association for the Study of Lung Cancer, and Association for Molecular Pathology. J Thorac Oncol, 2013, In press.]

NSCLC的分子靶向治疗将越来越依赖于分子靶点变异的分子诊断。临床实践中分子检测的标准化和标准流程的建立对于“提高临床实践能力”起到关键作用。ALK基因融合变异作为晚期肺癌中的第二个明确应用的分子分型,其诊断方法和流程仍需进一步结合临床数据进行优化。

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