Biomaterials：人类骨骼肌和运动神经元中的 ALS 突变对神经肌肉接头的完整性和功能有不同的影响

肌萎缩侧索硬化症(ALS)是一种使人衰弱的成人发病疾病，患者通常会在诊断后2-5年内走向死亡。这种疾病的特点是上下运动神经元进行性丧失，以及骨骼肌无力和消瘦。虽然ALS发病的原因仍未解决，但研究人员已将神经肌肉接头(NMJ)功能障碍确定为ALS进展的最早事件之一。虽然目前尚不清楚诱发NMJ功能障碍的过程，但最近的研究结果表明，骨骼肌可能与ALS NMJ破坏有关。

2022年8月19日，来自University of Central Florida的James J.Hickman课题组在Biomaterials上发表了题为“ALS mutations in both human skeletal muscle and motoneurons differentially affects neuromuscular junction integrity and function”的研究文章，该研究通过对人来源的骨骼肌和运动神经元研究其在ALS神经肌肉病理中的贡献，结果表明与运动神经元无关的ALS骨骼肌固有的病理缺陷也会影响神经肌肉接头功能障碍。

研究结果

1. iPSC衍生的骨骼肌和运动神经元之间的NMJ形成

研究者前期的工作已对两个SOD1系（SOD1L144P和SOD1E100G）进行功能表征，明确其表现出肌原性降低、肌管形态萎缩、线粒体功能受损以及响应电刺激的肌纤维收缩功能降低。接下来研究者对hSKMWT-hMNWT、hSKMSOD1-hMNWT、hSKMWT-hMNSOD1和hSKMSOD1-hMNSOD1共培养，包括与一个突变组织与健康组织（即hSKMSOD1-hMNWT、hSKMWT-hMNSOD1）配对的共培养物，以研究特定组织类型对ALSNMJ完整性的影响，而突变体hSKM-突变体hMN共培养物旨在研究两种组织类型中SOD1突变对NMJ功能的累加效应。

结果显示，这两种细胞类型的密切相互作用，表明NMJ形成（图1），共培养第14天和第17天的功能性NMJ测试验证了NMJ的形成。总体而言，在所有共培养变化中都观察到了NMJ（图2）。

图1：尼古丁乙酰胆碱受体(nAChR)的免疫细胞化学染色为绿色，表示骨骼肌和突触素(神经元轴突标记)为红色，显示室中NMJs的形成。

2. SOD1突变体培养物中的NMJ数

接下来研究者量化了在共培养的第14天和第17天的hSKMSOD1-hMNWT、hSKMWT-hMNSOD1和hSKMSOD1-hMNSOD1中的NMJ数量。结果显示，hSKMSOD1-hMNSOD1共培养物的NMJ数量最少，显着低于hSKMWT-hMNWT共培养物（图3A和B）。随后是hSKMSOD1-hMNWT共培养物（图2A和B），并且在共培养物的第14天，hSKMWT-hMNSOD1的NMJ数显着低于hSKMWT-hMNWT。然而，在共培养的第17天，hSKMSOD1L144P-hMNWT的NMJ数量比第14天略有增加，而在hSKMSOD1E100G-hMNWT中未观察到增加（图2B）。

图2：所有遗传组的hSKMWT-hMNSOD1、hSKMSOD1-hMNWT和hSKMSOD1-hMNSOD1共培养在第14天的平均NMJ数评估。

3. SOD1突变培养物的NMJ保真度

NMJ保真度是一种衡量跨突触的hMN-hSKM传输可靠性的方法，用于评估hMN或hSKM中的SOD1突变如何影响NMJ的功能完整性对体内刺激的反应。结果显示，与hSKMWT-hMNWT共培养物相比，所有ALSNMJ模型都表现出降低的收缩保真度，尤其是在测试的第14天和第17天，在较高的刺激频率（即1和2Hz）下（图3和4）。然而，与hSKMWT-hMNSOD1系统相比，hSKMSOD1-hMNWT和hSKMSOD1-hMNSOD1的共培养物具有低得多的NMJ保真度。

另外有趣的是，与SOD1E100GhMNs共培养的WThSKM通常表现出收缩保真度的显着下降（图3A、4A），而与SOD1L144PhMNs一起培养的那些没有显示收缩保真度缺陷的迹象，这表明从hMNs到hSKM的一些前馈恶化信号，以及不同突变之间的表型变异。结果表明所有ALS系统的功能性NMJ中断，这在与ALS hSKM的共培养中更为严重。

图3：分析第14天含有突变SOD1运动神经元和/或SKM的NMJ系统与相应WT条件下的NMJ保真度。

图4：分析含有突变SOD1运动神经元和/或SKM的第17天NMJ系统与相应WT条件的NMJ保真度。

4. SOD1突变体培养物中的NMJ稳定性和疲劳指数

由于在ALS临床病理学中报道的NMJ稳定性降低而形成的NMJ的稳定性，研究者测量该参数以检查各种NMJ模型在剧烈活动后维持功能性突触的能力。结果表明，ALS突变的hSKM显著降低了NMJ的稳定性，并且在一定程度上比ALS突变的MNs更严重（图5）。另外骨骼肌无力和易疲劳性是ALS的标志，研究者评估了ALS hSKM对NMJ疲劳指数的贡献，结果表明内在的hSKM功能障碍显着导致ALSNMJ疲劳（图6）。

图5：对两种SOD突变系hSKMWT-hMNWT、hSKMWT-hMNSOD1、hSKMSOD1-hMNWT和hSKMSOD1-hMNSOD1共培养14d时NMJ的平均稳定性进行量化。

图6：hSKMWT-hMNWT、hSKMWT-hMNSOD1、hSKMSOD1-hMNWT和hSKMSOD1-hMNSOD1第14天NMJ疲劳指数量化。

综上所述，James J.Hickman团队的这项工作证实了和运动神经元无关，ALS hSKM中内在形态和功能缺陷也会影响对NMJ的完整性和功能。此外，这项工作展示了ALS hSKM的存在的情况下，症状严重程度是如何提高的。这种情况下ALS hSKM并不是神经元功能障碍的结果，而可能是ALS发病机制中一个重要的因素。

因此，由于改善ALS hSKM状况可能有助于减轻症状的严重程度，在开发治疗方法时应把ALS hSKM的因素考虑进去。最后需要注意的是，LAS是一种具有许多相关基因突变的异质性疾病。虽然这项工作侧重于SOD1基因的突变，但本工作中描述的为生理学平台可以用于探索其他fALS相关突变以及sALS当中去。

参考文献

Badu-Mensah A, Guo X, Nimbalkar S, Cai Y, Hickman JJ. ALS mutations in both human skeletal muscle and motoneurons differentially affects neuromuscular junction integrity and function [published online ahead of print, 2022 Aug 19]. Biomaterials. 2022;289:121752. doi:10.1016/j.biomaterials.2022.121752

- END -

： ， 。   视频 小程序 赞 ，轻点两下取消赞 在看 ，轻点两下取消在看