免疫组化和PCR不是唯一解！NGS液体活检助力林奇综合征诊断并指导后续治疗

微卫星不稳定性（MSI）是一种可用于检测和治疗林奇综合征的标志物。尽管免疫组织化学（IHC）和聚合酶链式反应（PCR）等传统技术是MSI检测的标准，但下一代测序（NGS）的出现提供了新的可能性，尤其是循环DNA。本文介绍了一名 26 岁病例，该患者患有林奇综合征和BRAF突变的转移性结肠癌。传统检测和NGS的MSI结果不一致，给治疗决策带来了挑战。NGS检测提示MSI较高，推动患者参与免疫治疗试验，并取得了显著的临床缓解。该案例强调了全面的分子检测和跨学科合作的重要性，尤其是在MSI结果不明确的情况下。

背 景

微卫星不稳定性（MSI）是DNA错配修复缺陷（dMMR）的特征，其中突变的积累发生在整个基因组中，特别集中在微卫星的重复区域中。在实体瘤中，通常会对其进行评估，以初步确认林奇综合征、治疗方向和预后。大多数MSI-H肿瘤为偶发性，常与MLH1启动子高甲基化或BRAF V600E突变有关（特别是结直肠癌[CRC]，而其它肿瘤则由遗传性癌症易感综合征引起，例如林奇综合征，源于四种主要错配修复（MMR）基因之一的单等位基因胚系突变：MLH1、MSH2、MSH6、PMS2或EPCAM基因]。MSI-H CRC的肿瘤表型以右侧结肠、低分化黏液腺癌、发病早和免疫检查点抑制剂的缓解率高为特征。目前，dMMR检测的金标准是使用肿瘤组织样本进行免疫组织化学（IHC）和聚合酶链式反应（PCR）。然而，下一代测序（NGS）技术的演变和发展为MSI-H检测提供了新的方法，特别是使用cfDNA。后者引起了广泛关注，因为它是一种微创且易于重复的工具，克服了空间和时间异质性的问题，并允许通过迭代采样对疾病进行纵向监测。因此，人们尝试探究在MSI-H检测中使用传统检测和NGS工具之间的一致性，并且取得了不错的结果。然而，仍存在不一致的情况，因此对制定治疗决策产生挑战。本文提供了一个病例报告作为该问题的一个实际案例。

病 例

患者男，26 岁，无个人或家族癌症病史，在发烧和腹痛 1 周后住院。CT扫描显示右结肠原发性肿块，伴有局部炎症和盆腔积液，无远端转移。在这种情况下，患者接受了紧急手术。病理标本显示R0切除术，右结肠 7 cm浸润性黏液腺癌，47 个淋巴结中有 2 个阳性（T3N1，IIIA期）。对原发肿瘤进行分子检测发现KRAS野生型、BRAF V600E突变，IHC评估MLH1–MSH2–MSH6–PMS2正常表达。由于肿瘤细胞不足（<20%），MSI检测的PCR检测结果无法判读。根据指南建议，患者在 2018 年 1 月至 7 月期间接受了 12 个周期的辅助化疗，化疗方案为静脉（IV）FOLFOX方案[奥沙利铂，85 mg/m²，IV；5-氟尿嘧啶（5-FU），2,400 mg/m²，IV；5-FU，400 mg/m²；亚叶酸钙（LV），400 mg/m²]。由于患者较为年轻，因此考虑进行遗传咨询，并进行了NGS检测，包括基因MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、EPCAM、APC、MUTYH POLD1和POLE，未检测到任何有害突变（表1）。发现MSH2基因 13 号外显子存在 3 类意义不明杂合变异c.2012A>C/p.Asn671Thr。由于患者年龄较小，专家组建议作为Lynch样病例进行上下消化道内镜监测（每 2 年一次）。

▲表1 检测结果汇总

2018 年 12 月患者出现可切除的肝脏复发，行左肝切除术。由于复发为肝内复发且发生在辅助化疗结束 6 个月后，多学科团队（MDT）决定进行系统性辅助治疗，即静脉FOLFIRI方案（伊立替康，180 mg/m²；5-FU，2400 mg/m²静脉注射 46 小时；5-FU，400 mg/m²；LV，400 mg/m²）联合肝动脉内注射奥沙利铂。患者于 2019 年 2 月至 5 月接受了 3 个月的化疗，耐受性良好。治疗结束时患者实现无病生存。3 个月后，即 2019 年 9 月，CT扫描显示病情进展，并出现腹膜后淋巴结。由于患者存在BRAF V600E突变，MDT决定采用达拉非尼、曲美替尼和帕尼单抗进行靶向治疗（当时还没有公布BEACON试验的结果）。患者取得部分缓解，无进展期为 16 个月（2019 年 9 月至 2021 年 2 月之间），但由于与帕尼单抗相关的 2-3 级皮肤毒性，耐受性有限。2021 年 1 月，该疾病在腹膜后、纵隔和左锁骨上淋巴结再次进展。尽管已知存在BRAF V600E突变和pMMR状态，研究人员决定进行新的NGS分析，该分析使用了液体活检和既往标本（来自肝脏手术）。结果显示，存在MSI-H、肿瘤突变负荷 (TMB) 为 17.65 Muts/Mb，以及BRAF V600E突变，而液体活检证实了MSI-H、TMB-H（27 Muts/Mb）和BRAF V600E突变等（表1）。根据MSI-H结果，患者被纳入一项临床篮子试验，接受 34 个月的阿替利珠单抗二线治疗，获得部分缓解（-76%）和完全代谢缓解，且具有良好的治疗耐受性（图1）。患者的诊断和治疗过程如图2所示。

▲图1 患者基线、最佳反应和最后一次评估时的CT影像

▲图2 治疗时间线

面对这些不一致的结果，研究人员使用来自肝转移的标本进行了MSI分析。分析显示NGS中存在MSI-H表型，但在IHC检测仍为微卫星稳定（MSS）。更换panel后的第二次NGS检测证实了肝标本中存在MSI-H。对本文病例进行MDT讨论后，对MLH1进行了甲基化检测，结果为阴性。该患者被认为患有MSI-H肿瘤。在确认MSI-H结果后，重新进行了胚系分析，并决定对MSH2 13号外显子c.2012A>C/p.Asn671Thr 进行基于甲基化耐受性的功能分析。结果证实了该变异具有致病性，并在遗传MDT中讨论了本文病例。该变异在FrOG数据库被归类为可能致病，研究人员认为患者患有林奇综合征。截至 2024 年 1 月底进行的评估显示完全缓解，并决定停止免疫治疗。患者亲属健康，且未进行任何基因检测。

讨 论

本文介绍了一名 26 岁男性病例，该患者罹患转移性结肠癌，IHC/PCR和NGS的MSI结果之间不一致。在进展期间进行的NGS检测（液体活检和手术组织）得出了MSI-H和TMB-H的结果，这为接受免疫疗法提供了可能性，并取得了令人印象深刻的效果。

在DNA测序出现之前，MSI检测主要依赖于MMR蛋白的IHC和“Bethesda组”五个高度保守位点的PCR评估。然而，鉴于在某些情况下，活检可能没有足够比例的肿瘤细胞，无法正确分析MMR状态，因此相当多的患者可能会存在治疗选择有限。

根据欧洲肿瘤内科学会（ESMO）和美国临床肿瘤学会（ASCO）的建议，当怀疑患有林奇综合征时，应在诊断为CRC时评估患者的MMR状态；对于转移性疾病，也应进行初步分子检查，以确定其对免疫疗法使用的预测价值[证据级别（IA）]。应使用常规技术进行检测，例如MMR-IHC和/或MSI PCR检测。此外，如果使用NGS panel进行MMR检测，则必须具有与上述技术的等效性。

在本病例中，IHC结果表明尽管存在错义变异， MSH2蛋白仍有表达。虽然林奇综合征筛查通常依赖于IHC和/或MSI检测，基因检测仅用于特定病例，但由于患者年龄较小且MSI检测结果不确定，因此有必要进行进一步调查，从而准确识别该综合征。本文患者在初次诊断时，使用常规技术无法判断MSI状态，可能是由于标本细胞数（<20%）或黏液组织学特征导致的。患者接受了标准治疗，但疾病控制期较短。

有多种原因可能导致MSI假阴性结果：①技术问题（对 <5.5 mm的组织碎片进行MSI检测可能产生假阴性MSI结果）；②黏液组织学；③林奇综合征（许多患有林奇综合征的个体可能患有MSI-L或MSS表型的肿瘤，导致假阴性结果）。得益于NGS，研究人员能够发现患者患有MSI-H肿瘤，随后他在篮子试验中接受了阿替利珠单抗治疗，这是当时唯一可能获益的方案。

2020 年，Keynote-177 试验公布了帕博利珠单抗治疗MSI-H患者的结果，结果显示无进展生存期有所改善，而且与标准化疗相比，缓解率为 43.8%，随后成为该人群的一线治疗，甚至对携带BRAF V600E突变的患者也有效。得益于II期试验Checkmate 142（2022）的结果，纳武利尤单抗随后获批用于相同情况（联合或不联合伊匹木单抗）。本文患者携带BRAF V600E突变——直到最近才认为该突变是散发性MSI肿瘤的标志。然而，最近在林奇综合征患者中也发现了BRAF V600E突变的存在；因此，如果有临床指征，即使存在BRAF V600E突变也不应排除胚系检测。

总之，应关注MSI状态，尤其是年轻患者的MSI状态，在制定治疗决策中发挥了关键作用。当结果不明确时，需要进行相关咨询，因为准确的诊断可能会改变患者生活。如果无法从肿瘤组织直接确定，cfDNA是一种选择。

参考文献：

Rodriguez JE, Vasseur D, Bani MA, Cabaret O, Cotteret S, Muleris M, Golbarg V, Malka D, Pudlarz T, Caron O, Smolenschi C. Case report: Microsatellite instability determination is not always black and white in Lynch syndrome diagnosis. Front Oncol. 2024 Jun 18;14:1396869. doi: 10.3389/fonc.2024.1396869. PMID: 38957326; PMCID: PMC11217479.