除了抗癌、降糖降血脂...新研究再挖出“仙草”新功用：可抗衰老改善认知障碍！

衰老是一种缓慢而渐进的生理变化过程，是不可避免、不可逆转的自然现象。衰老的速度受到遗传、环境、饮食和生活习惯之间复杂的相互作用的影响。衰老往往伴随着生理功能的下降，导致日常生活活动（ADL）减少，从而增加医疗和社会资源需求。人们已经提出了几种解释衰老过程的理论，其中最著名的是Denham Harman博士在1956年提出的自由基衰老理论（FRTA）。

根据FRTA，衰老是由体内的自由基引起的，自由基会导致脂质过氧化、蛋白质氧化和DNA损伤。既往文献报道氧化应激在与衰老相关的神经或神经退行性疾病的发病机制中起关键作用。

d 半乳糖（D-gal）是一种还原糖，在体内代谢时产生ROS。它通过非酶糖基化与蛋白质和多肽上的游离胺相互作用，产生晚期糖基化终产物（AGEs），间接刺激ROS的产生，最终导致氧化应激。因此，d-gal诱导的动物衰老模型用于模拟大脑自然衰老或年龄相关性神经退行性疾病的特征，已得到国际上的认可。本研究将采用D-gal构建衰老大鼠模型。

灵芝是一种药用食用菌，几个世纪以来在东亚国家被认为是一种保健和延年益寿的药草。它含有多种生物活性化合物，如多糖、三萜、腺苷和小分子蛋白质。研究表明，灵芝具有抗肿瘤、抗炎、降血脂、降糖、抗氧化、免疫调节、保肝、抗动脉粥样硬化等多种作用。本研究选用亚洲广泛使用的灵芝品种——松山灵芝（Ganoderma tsugae）的提取物（GTDE，200μg/ kg /天）对d-gal诱导的衰老大鼠进行治疗，旨在研究灵芝能否减轻d -gal诱导的衰老大鼠的氧化应激和记忆缺陷。

GTDE对大鼠生理参数无明显影响

如表1所示，各组体重、脑重差异无统计学意义（增重：p = 0.9357， F = 0.1389；脑重量：p = 0，3334， F = 1.199）。D-gal+GTDE组的生理参数值与对照组相似。与对照组相比，D-gal组血红蛋白浓度略低，红细胞（RBC）计数略高，白细胞（WBC）计数下降（Hb： p = 0.8843， F = 0.2155 WBC： p = 0.7221， F = 0.4484；RBC， p = 0.5034， F = 0.8190）。

在喂食GTDE的老龄大鼠中，这些参数均有向对照组恢复的趋势，但各生理参数的差异无统计学意义。上述实验结果表明，D-gal注射和GTDE口服25周对大鼠基本生理参数无明显影响。

GTDE提高d-gal诱导的衰老大鼠对环境的警觉性

开放场地测试常利用动物的触控行为来评价运动、探索、焦虑等行为或情绪。在本研究中，试验是在D-gal注射和口服GTDE 18周后进行的（图1a）。图1b为实验过程中大鼠活动的热图。热图上的颜色代表穿越或停留在某一区域的时间，红色代表最长时间30秒，蓝色代表最短时间10秒。如图所示，除D-gal组外，各组大鼠普遍表现出触点趋同行为。

因此，我们进一步分析了大鼠停留在中心区的频率。结果如图1c所示（单因子方差分析p<0.05，Tukey多重比较测试F = 3.636， p = 0.0328）表明， 与其他组相比，D-gal组大鼠进入中心区的频率最高，而D-gal + GTDE组的频率明显低于D-gal组。

GTDE改善d-gal诱导的衰老大鼠的短期记忆

熟悉/新颖的物体识别测试和熟悉/新颖的位置识别测试都是识别记忆的高级验证方法。在D-gal注射和口服GTDE 18周后进行新型物体识别（NOR）和新型位置识别（NLR）测试（图1a）。结果表明，D-gal组在探索新的物体（图1d）和新的位置（图1e）上花费的时间明显短于探索熟悉的物体和熟悉的位置。这表明D-gal组对物体和位置的识别能力受损，短期记忆下降。D-gal+GTDE组探索新物体和新位置的时间增加，表明GTDE减轻了短期记忆的恶化（图1d和1e）（图1d： 单因素方差分析p<0.05，Tukey多重比较检验，F = 5.158， p = 0.0075；图1e： 单因素方差分析 p<0.05，Tukey多重比较检验，F = 5.442， p = 0.0059）。

GTDE改善d-gal诱导的老年大鼠的空间记忆障碍

Morris水迷宫用于评估动物的空间学习和记忆能力。实验开始时，对大鼠进行初步训练，使其形成长期记忆，并在D-gal注射和口服GTDE 19周后进行验证（图1a）。图1f为实验过程中大鼠活动的热图。热图上的颜色代表穿越或停留在某一区域的时间，红色代表最长时间30秒，蓝色代表最短时间10秒。

结果表明，除D-gal组外，所有组中的大鼠在平台上停留的时间明显长于迷宫的其他区域。因此进一步分析了大鼠停留在平台上的频率（图1g： 单因素方差分析p< 0.05， Tukey多重比较检验，F = 4.976， p = 0.0034）。分析表明，D-gal组比对照组更不易到达平台。相比之下，D-gal+GTDE组到达平台的可能性更大，这与对照组相似。上述结果提示，衰老大鼠出现了年龄相关性空间记忆障碍，随着GTDE的施用而缓解。

GTDE改善d-gal诱导的衰老大鼠的工作记忆

除了用于经典的空间长期记忆测试外，Morris水迷宫还可以通过每天将平台移动到一个新位置来评估工作记忆，工作记忆代表着学习新事物的能力。在D-gal注射和口服GTDE 23周后进行工作记忆测试。从图1h可以看出，D-gal组的平台定位时间随着试验天数的增加并没有显著提高。相比之下，对照组和D-gal+GTDE组有改善的趋势；D-gal+GTDE组恢复显著。这表明工作记忆随年龄增长而下降，但这种下降可以被GTDE所阻止（图1h： 单因素方差分析p = 0.0893，Tukey多重比较检验，F = 1.842）。

GTDE减弱了衰老引起的海马和大脑皮层树突支的减少

树突分支的复杂性决定了神经元是否具有良好的突触功能，并影响神经元处理和巩固信息的能力。图2a为各类群的代表性高尔基染色。图2b-2e为海马和大脑皮层的树突分支的Sholl分析结果，图2f-2i为海马和大脑皮层的总树突分支点和终点。结果表明：

（1）在海马CA1区域的树突状分支交叉点，D-gal组交叉点比对照组少，D-gal+GTDE组交叉点比D-gal组略多。但各组间差异无统计学意义（图2b： 单因素方差分析p > 0.05，Tukey多重比较检验，距离体细胞108μm：F = 2.367，p = 0.0786；距体细胞120μm：F = 2.559，p = 0.0623）。图2f为各组树突分枝点和终点个数。D-gal组与对照组在树突分支点数量上没有差异，但树突终末点略少于对照组。D-gal+GTDE组树突分支点数和树突终末点数均略高于对照组，但差异无统计学意义（图2f： 单因素方差分析p > 0.05， Tukey多重比较检验，分支点：F = 1.442， p = 2.2384；终点：F = 1.149， p = 0.3359）；

（2）对各组海马CA3区神经元的Sholl分析显示，D-gal组的神经元相交点少于对照组，在距离躯体25-50 μm的距离内差异具有统计学意义（图2c： 单因素方差分析p< 0.05， Tukey多重比较检验，距体细胞36 μm： F = 7.271， p = 0.0003；距体细胞108 μm： F = 3.671， p = 0.0166）。在距离为20-108 μm的D-gal+GTDE和D-gal群中，它们明显有更多的分支点（图2c）。从图2g中树突分支点和终止点的计数可知，D-gal组树突分支点和终止点均少于对照组，两组间差异有统计学意义。D-gal+GTDE组比D-gal组有更多的树突分支点和终点，两组间差异有统计学意义（图2g： 单因素方差分析p< 0.05， Tukey多重比较检验，分支点：F = 7.933， p = 0.0001；终点：F = 9.719， p<0.0001）；

（3）对各组海马齿状回区域神经元进行Sholl分析，发现D-gal组与对照组相比交集数较少，但差异无统计学意义（图2d）。与D-gal组相比，D-gal+GTDE组144 ~ 156 μm距离内的交点较多，差异有统计学意义（图2d： 单因素方差分析p < 0.05， Tukey多重比较检验，距体细胞144 μm：4.371，p = 0.0064；距体细胞156 μm：4.590，p = 0.0049）。D-gal组树突分支点及终点均少于对照组，但差异无统计学意义。D-gal+GTDE组比D-gal组有更多的树枝状分支点和终末点；树突终末点数差异有统计学意义（图2h： 单因素方差分析 p < 0.05， Tukey多重比较检验，分支点F = 2.852， p = 0.0433；终点：F = 9.719， p<0.0001）。这些结果表明，GTDE能减弱衰老大鼠海马某些区域树突分支的减少。

对大脑皮层神经元的Sholl分析结果显示，D-gal组与对照组相比交叉点较少，在60 ~ 162 μm距离内差异有统计学意义（图2e）。与D-gal组相比，D-gal+GTDE组在60 ~ 100 μm距离内的交点较多，差异有统计学意义（图2e： 单因素方差分析p<0.05， Tukey多重比较检验，距体细胞60 μm：F = 8.863， p&lt；0.0001； 距体细胞96 μm： F = 9.264， p<0.0001）。从图2i中可以看出，D-gal组的分支点和终点明显少于对照组。但D-gal+GTDE组的分支点和终末点明显多于D-gal组。D-gal+GTDE组的分支点和终点也明显多于对照组，但差异无统计学意义（图2i： 单因素方差分析p < 0.05， Tukey多重比较检验，分支点F = 8.440， p<0.0001；终点：F = 8.599， p<0.0001）。上述结果表明，GTDE可降低衰老大鼠大脑皮层树突分支的减少。

GTDE降低脂质过氧化产物表达

为了确定GTDE是否通过其抗氧化活性减轻衰老对神经元形态和功能的影响，评估了大脑皮层脂质过氧化产物4-羟基壬烯醛（4-HNE）的浓度。图3a和图3b分别为代表性的免疫荧光图像和重复试验的定量结果。结果表明，D-gal组大脑皮层4-HNE染色强度明显高于对照组。使用GTDE导致4-HNE染色强度降低（图3a和3b： 单因素方差分析p < 0.05，Tukey多重比较检验，F = 59.794， p<0.0001）。

GTDE增加大脑中抗氧化酶的表达

通过测定抗氧化蛋白的表达水平来验证GTDE通过其抗氧化活性减弱衰老效应的理论。为了评估GTDE是否能减轻d-gal诱导的衰老大鼠脑组织的氧化损伤，测量了大脑皮层 （图3d和3f）（图3f： 单因素方差分析p < 0.05，Tukey多重比较检验，SOD： F = 58.586， p<0.0001；过氧化氢酶：F = 24.958， p<0.0001）和海马（图3c和3e）（图3e： 单因素方差分析p< 0.05，Tukey多重比较检验，SOD： F = 137.19， p<0.0001；过氧化氢酶：F = 88.101， p<0.0001） SOD-1和过氧化氢酶的蛋白表达水平。图3c-3f分别为具有代表性的Western blot和重复试验的定量结果。结果表明，D-gal降低了大鼠海马和大脑皮层SOD-1和过氧化氢酶的表达水平，而GTDE使其表达水平恢复到基本正常，且D-gal组与D-gal+GTDE组差异有统计学意义。

GTDE降低衰老诱导的炎症小体表达

多项研究表明，衰老可诱导氧化应激，引起炎症反应增加。因此，我们旨在确定GTDE是否降低了NLRP3炎症小体的表达。首先，用免疫荧光法观察大脑皮层炎症小体表达的变化。图4a和4b分别为具有代表性的免疫荧光图像和定量的NLRP3阳性细胞。可以观察到，D-gal组大脑皮层NLRP3阳性细胞比对照组增加0.8倍，而D-gal + GTDE组NLRP3阳性细胞比D-gal组减少0.9倍。与对照组相比，仅用GTDE治疗的大鼠（GTDE组）的炎症小体表达也出现了最小程度的下降（图4a和4b）（图4b： 单因素方差分析p< 0.05， Tukey多重比较检验，F = 26.145， p<0.0001）。

此外，与对照组相比，D-gal诱导组每个细胞内NLRP3的表达都增加了，而GTDE可以降低这种表达（图4a，放大图像）。图4c-4f分别为具有代表性的Western blot和重复试验的定量结果。D-gal组海马组织NLRP3蛋白表达较对照组提高0.14倍。D-gal+GTDE组表达量较D-gal组降低0.23倍，差异有统计学意义（图4e： 单因素方差分析 p< 0.05， Tukey多重比较检验，F = 30.163， p<0.0001）。NLRP3蛋白表达水平的脑皮层组织D-gal组是对照组的0.2倍，而D-gal+GTDE组的表达水平低于D-gal组的0.21倍，与表达水平的差异具有统计学意义（图4 f： 单因素方差分析p< 0.05， Tukey多重比较检验，F = 17.956， p<0.0001）。GTDE组海马和大脑皮层NLRP3蛋白表达水平均低于对照组，但差异无统计学意义。

GTDE减少AGEs的形成

研究人员报告说，衰老通常会导致AGES的形成增加。上述实验结果证实，氧化应激和炎症反应在D-gal组中显着增加。因此，我们旨在研究D-gal诱导的衰老组中AGEs的形成是否显着增加，以及GTDE是否减弱了AGEs的积累。从图4g所示结果，D-gal组血清中AGEs浓度比对照组高0.51倍，而D-gal+GTDE组AGES浓度比D-gal组低0.46倍，与对照组相当。GTDE组AGEs浓度比对照组低0.19倍，进一步证明了GTDE对AGEs形成的抑制作用（图4g： 单因素方差分析p<0.05， Tukey多重比较检验，F = 39.530， p<0.0001）。

GTDE 增加 BDNF 表达

BDNF促进神经元存活和分化，诱导突触可塑性。在衰老的大脑中，BDNF表达普遍呈下降趋势，提示神经发生和神经元活性降低。我们旨在确定除发挥抗炎作用外，GTDE是否也能够通过维持或促进BDNF的表达来维持大脑健康。通过Western blotting比较各组海马和大脑皮层中BDNF的表达水平，发现D-gal组海马和大脑皮层中BDNF的表达水平均低于对照组，而D-gal+GTDE组两种组织中BDNF的表达量均高于D-gal组。

此外，GTDE组在两种组织中BDNF的表达均高于对照组（图5a-5d： 单因素方差分析p< 0.05， Tukey多重比较检验，皮质： F = 39.069， p<0.0001；海马：F = 604.00， p<0.0001）。这些结果表明，GTDE可能促进或维持海马和大脑皮层BDNF的表达，有利于维持神经元的健康。

总的来说，GTDE增加了大脑的抗氧化能力和BDNF表达，保护神经元的树突结构，减少衰老引起的神经元损伤，从而减轻衰老引起的认知障碍。

原文来源：

Kuo HC, Tong SY, Chao MW, Tseng CY. Ganoderma tsugae prevents cognitive impairment and attenuates oxidative damage in d-galactose-induced aging in the rat brain. PLoS One. 2022;17(4):e0266331. Published 2022 Apr 7. doi:10.1371/journal.pone.0266331