流感佐剂疫苗的研究进展

流感是一种由甲型和乙型流感病毒引起的急性高度传染性呼吸道疾病。每年流感流行都是由几种不同的季节性流感病毒（即A/H1N1, A/H3N2, B/Yamagata, and B/Victoria）引起的。流感给人类的健康带来了沉重负担：世界卫生组织（WHO）估计，每年流感导致全球300万至500万例严重疾病，其中29万至65万人死亡。

目前，各种疫苗和抗病毒药物被用于预防和治疗流感。然而，目前的流感疫苗对感染的有效性可能并不理想。其中一个原因是，目前的季节性流感疫苗是在下一个流感季节开始前几个月生产的，因此，疫苗株的抗原性可能与下一个季节流行的优势株的抗原性不完全匹配。此外，老年人通常表现出较低的免疫反应和疫苗对感染的有效性。

流感疫苗的免疫原性可以通过添加佐剂来提高。理想的佐剂可以提高疫苗的效力，并具有很好的安全性。最近，一种含有水包油佐剂MF59的流感疫苗FLUAD在美国和其他国家获得了65岁及以上人群的许可。新佐剂流感疫苗可能代表了未来应对流感大流行的未来方向。

目前，有三种获得批准的季节性流感疫苗可供人类使用：灭活疫苗、减毒活疫苗和重组血凝素疫苗。这些疫苗由三种或四种不同类型的流感病毒组成，世界卫生组织每年对其进行更新，以反映最新的流行毒株。目前的流感疫苗通常是三价或四价的，含有两种甲型流感毒株（即A/H1N1和A/H3N2）和一种或两种预计在下一个季节传播的乙型流感病毒。已经开发出各种类型的流感疫苗，批准的疫苗如下表所示。

灭活疫苗

流感灭活疫苗有三种：全病毒颗粒疫苗、裂解病毒疫苗和亚单位疫苗。20世纪40年代开发的灭活全病毒颗粒疫苗由缺乏传染性但保持病毒颗粒形状的病毒颗粒组成，包括病毒基因组RNA和所有病毒结构蛋白。灭活的全病毒颗粒疫苗可有效诱导体液和细胞免疫反应。全病毒颗粒灭活疫苗保留了进入靶细胞的能力但不增殖，然而由于病毒颗粒的脂质成分，人们担心其热原性和不良反应。

因此，这种疫苗被裂解病毒疫苗取代，裂解病毒疫苗是通过用乙醚或洗涤剂处理纯化的病毒以去除病毒包膜制备的。亚单位疫苗主要包括HA和神经氨酸酶蛋白。裂解和亚单位疫苗可诱导先前感染过流感病毒的人产生免疫力；然而，它们不能在从未感染过的婴儿中诱导足够的免疫力。这是因为裂解疫苗失去了大部分病毒单链RNA，并且由于缺乏对先天免疫受体的信号传导而降低了免疫原性。

减毒活疫苗

减毒流感活疫苗（LAIV）是基于低温下在胚胎鸡蛋中连续传代产生的冷适应、温度敏感和减毒变体。例如，FluMist®是一种减毒流感活疫苗，用于2至49岁的健康人群。病毒具有来自循环病毒的表面糖蛋白，而其内部基因来自冷适应的主供体病毒。因此，在鼻内接种这些疫苗后，它们的复制仅限于上呼吸道，那里的温度低于正常体温。与自然感染类似，减毒活疫苗在上呼吸道诱导粘膜IgA反应和交叉反应性T细胞反应。病毒复制过程中产生的双链病毒RNA被内体先天免疫受体TLR3和视黄酸诱导基因（RIG-I）识别，导致干扰素介导的抗病毒反应和促炎细胞因子反应的诱导。

重组HA疫苗

重组HA疫苗含有通过使用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中产生的纯化HA。Flublok®四价疫苗是一种重组流感疫苗，分别于2017年和2020年在美国和欧盟批准用于18岁及以上人群。自2020-2021年流感季节以来，该疫苗已在美国和欧盟某些国家上市。接种Flublok®疫苗的人患流感的概率比接种普通灭活流感疫苗的人低30%，这很可能是因为重组HA疫苗含有三倍量的HA蛋白。在Flublok®生产过程中，不需要种子病毒和鸡胚，因此重组疫苗的生产速度比基于鸡胚或细胞的疫苗更快。

有效性

流感病毒由于抗原漂移而不断变化，很难预测下一季流行的病毒。如果疫苗株和流行株的抗原性不匹配，则流感疫苗对感染的有效性降低。世界卫生组织通过考虑世界各地的流行情况来选择疫苗株；然而，在一些情况下，抗原性不匹配，导致疫苗对感染的有效性不理想。高剂量疫苗（如Fluzone高剂量）和含佐剂的疫苗（如FLUAD®）已被开发为更有效的疫苗。这些疫苗显示出良好前景，具有比传统疫苗更高的保护率。

提高疫苗抗感染效力的最有效策略之一是添加佐剂。就流感疫苗而言，佐剂可有效增强免疫原性，并减少保护所需的病毒抗原量和所需的疫苗接种次数。此外，佐剂可以扩大对抗原变体的反应性，并有效对抗疫苗株和循环病毒之间的抗原错配。许多佐剂已被批准用于流感疫苗，包括铝佐剂、MF59、AS03、AF03和病毒体。

铝佐剂

铝佐剂，包括氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝钾，是最常见的佐剂，自20世纪30年代以来一直用于疫苗。在含有铝佐剂的百白破疫苗被成功证明能在人类中引发保护性免疫后，人们也开发了一种与铝佐剂联合的流感疫苗；然而，它没有表现出足够的免疫反应。直到MF59的开发，流感疫苗佐剂的研究才取得重大进展。

MF59

MF59由角鲨烯水包油乳液组成，用两种表面活性剂（聚山梨醇酯80和山梨醇三油酸酯）乳化。MF59诱导Th1和Th2型免疫反应以及一些特定细胞因子/趋化因子的释放，如IFN-γ、CCL2、CCL3、IL-8和IL-5。MF59被用于季节性流感疫苗FLUAD，甚至在老年人中也能增强免疫反应。FLUAD于1997年在意大利首次获得批准，随后于2015年在美国和欧洲获得批准，用于65岁及以上人群。此外，FLUAD四价流感疫苗也已被批准用于该老年人群，并在美国2020-2021年季节上市。与未添加佐剂的疫苗相比，MF59佐剂季节性流感疫苗在老年人和儿童中引发更强的免疫反应。

AS03

AS03是一种由角鲨烯、DL-α-生育酚和聚山梨醇酯80组成的佐剂，用作甲型H1N1 pdm09和H5N1禽流感病毒的疫苗。AS03触发短暂的NF-κB依赖性先天免疫反应，导致在注射部位和引流淋巴结产生细胞因子和趋化因子，包括CCL2、CCL3、IL-6、CSF3和CXCL1，从而诱导免疫细胞迁移。AS03佐剂A（H1N1）pdm09疫苗在老年人中比非佐剂疫苗诱导更高的抗体反应。

AF03

AF03是一种水包油佐剂，用于甲型H1N1流感病毒裂解疫苗Humenza，但从未上市。尽管AF03已被报道在动物模型中增强体液和细胞免疫反应，但其机制仍在很大程度上不清楚。

病毒体

病毒体表面有流感抗原，模仿病毒，可以被认为是一种病毒样颗粒（VLP）。通过模仿病毒，病毒体可以将抗原带入抗原呈递细胞，并在淋巴系统中运输。Inflexal® V是一种三价病毒体疫苗，含有来自世界卫生组织推荐的疫苗株的HA和NA。1997年在瑞士获得批准后，它被引入了世界各地，但现在已经不复存在。它在健康和免疫功能受损的老年人、成年人和儿童中诱导强烈的免疫反应，类似于自然病毒感染。

与佐剂疫苗相关的不良反应

流感疫苗需要足够有效；然而，也必须考虑副作用。在大流行性H1N1流感疫苗中提出了关于水包油佐剂AS03的安全性问题。报告了该疫苗的局部和全身不良反应，尽管影响并不严重。在一些国家，AS03佐剂疫苗与儿童发作性睡病发病率增加有关。然而，最近的研究表明，发作性睡病的诱因可能是大流行性H1N1流感病毒的病毒蛋白，而不是佐剂AS03。1型嗜睡症是由下丘脑视网膜神经元的自身免疫破坏引起的。由于下视蛋白和病毒抗原肽之间的分子模拟，识别下视蛋白肽的局部CD4+T细胞反应可能受到流感病毒抗原的刺激，导致靶向下视蛋白神经元的交叉反应性自身免疫反应。

MF59和铝佐剂在H5N1禽流感病毒重组裂解疫苗中的抗体反应已在临床试验中进行了评估。与铝佐剂相比，MF59增加了对病毒的中和抗体反应。未观察到疫苗接种引起的严重不良反应。铝佐剂组和MF59佐剂组之间的全身反应（如发烧、不适和头痛）没有差异。

皂苷

尽管铝佐剂在疫苗中使用已有很长时间，但这种佐剂诱导体液免疫，而不是细胞免疫。基于皂苷的佐剂已存在于兽医用疫苗中，可诱导体液和细胞免疫。Quil A及其衍生物QS-21已被评估用于人类流感疫苗佐剂，但使用这些佐剂的疫苗与不使用的疫苗在诱导免疫方面没有明显的优势。

2013年H7N9禽流感病毒出现后，来自Novavax的研究人员宣布，他们的H7N9疫苗临床试验成功。他们在H7N9 VLP疫苗中添加了基于皂苷的ISCOMATRIX佐剂，尽管H7病毒被认为具有较低的免疫原性，但添加皂素佐剂比铝佐剂或无佐剂诱导的免疫原率更高。

Matrix M是另一种基于皂苷的佐剂，已在1期临床试验中作为病毒体H5N1流感疫苗的佐剂进行了评估。用于季节性流感的Matrix M佐剂四价纳米颗粒疫苗也在3期随机对照试验中进行了评估。与获得许可的四价灭活流感疫苗相比，该疫苗在65岁以上的老年人中引发了更高的体液和细胞免疫。与单独的疫苗相比，Matrix M仅需要更少的抗原来诱导免疫反应。

TLR激动剂

Poly I:C是一种合成的TLR3激动剂，具有类似dsRNA的结构。Poly I:C12U已被测试用于鼻流感疫苗的佐剂，据报道显示出高粘膜免疫原性。此外，Rintatolimod与季节性流感疫苗联合使用可诱导针对其他亚型流感的交叉反应性IgA。PIKA也是一种稳定的dsRNA，在动物研究中，通过皮下注射和鼻内免疫，已被证明在H1、H3和H5亚型流感病毒的疫苗中作为佐剂是有效的。

吡喃葡萄糖基脂质A（GLA）是TLR4配体，也被应用于为佐剂。在2期研究中评估了GLA佐剂H5N1流感病毒疫苗与铝佐剂疫苗的HI抗体滴度，结果显示：用GLA佐剂免疫的人群比用铝佐剂免疫的人群具有更高的HI抗体滴度，并且需要更少的抗原。

鞭毛蛋白是细菌鞭毛的主要成分，也是TLR5配体，已被检测应用于佐剂。在1/2期试验中，由大肠杆菌表达的融合鼠伤寒沙门氏菌2型鞭毛蛋白（STF2）和H1HA球形结构域的重组蛋白在健康成年人和老年人中诱导了高HI抗体滴度。

在过去的十年里，许多研究都集中在通用流感疫苗的开发上，重点是开发针对流感病毒蛋白保守区的疫苗策略。对诱导异源毒株交叉保护的通用流感佐剂疫苗也在研究中。在最近的一份报告中，TLR7激动剂DSP-0546LP显示在小鼠中诱导Th1偏向性免疫，如IFN-γ和IgG2c抗体的产生，并增强对其它H1N1和H3N2亚型病毒的交叉保护。机制主要来源于ADCC作用，而不是交叉中和抗体。ADCC诱导的交叉保护免疫不仅由TLR7诱导，还可以由TLR9诱导。因此，TLR激动剂作为佐剂有望诱导高反应原性和交叉免疫反应。

随着我们对先天免疫发展的不断深入理解，各种新佐剂正在被开发作为流感疫苗的佐剂。佐剂有助于提高疫苗对感染的有效性。不仅增强免疫反应，而且扩大了对抗原变体的反应范围。因此，佐剂疫苗似乎更适合对抗经常发生抗原漂移的流感病毒。佐剂的添加还可以节省诱导足够免疫力所需的抗原的剂量，这将允许在流感大流行期间快速分发疫苗。因此，对佐剂的进一步研究将使我们更深入地了解其功能，并有助于开发更安全、更具免疫原性的佐剂流感疫苗。

参考文献：

1. Advances in Adjuvanted Influenza Vaccines. Vaccines (Basel).2023 Aug 21;11(8):1391.